趙 穎 牛膺筠 周占宇

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是我國老年人主要致盲眼病之一。AMD的發(fā)生與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的慢性氧化損傷關(guān)系密切［1］。我們此前研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫誘導(dǎo)的累積性氧化損傷可以引起體外培養(yǎng)的人RPE細胞形態(tài)呈老年性改變，并導(dǎo)致其凋亡和壞死［2］，但具體機制尚不清楚。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，通過過氧化氫氧化損傷制作體外培養(yǎng)的人RPE細胞衰老模型，對人RPE細胞衰老的機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM-F12培養(yǎng)基、新生牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素(美國Gibco生物技術(shù)公司)，人RPE細胞(ARPE-19細胞株，貨號:CRL-2302;美國細胞培養(yǎng)收集公司)，過氧化氫(美國 Sigma公司)，碘化丙啶和羅丹明123染料(美國 Molecule Probe公司)，Caspases-9單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，PV6001免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 取生長良好的人RPE傳代細胞，以每孔1×106個接種于4個6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將原培養(yǎng)基吸出，換入新的DMEM-F12培養(yǎng)液，取4孔為正常對照組，其他20孔作為過氧化氫處理組加入600 μmol·L-1的過氧化氫，按過氧化氫的作用時段不同設(shè)1 h組、6 h組、12 h組、24 h組及72 h組，每組4孔。

1.2.2 流式細胞術(shù)測定細胞周期 各組經(jīng)胰蛋白酶消化收獲細胞，1 000 r·min-1離心5 min，離心半徑為12 cm，棄上清液，輕震蕩離心管使細胞脫壁，緩慢加入1 mL體積分?jǐn)?shù)75%的冷乙醇固定，4℃過夜。1 000 r·min-1離心5 min，PBS液洗2次，加入100 μL 的 10 ×PI溶液，加入 100 μL RnaseA，37 ℃孵育30 min;流式細胞儀檢測分析(激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長590 nm)，得出 G0/G1期細胞所占比例。

1.2.3 檢測線粒體膜電位 各組經(jīng)胰蛋白酶消化制備成細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清后重懸于不含鈣鎂的Hank液，加入羅丹明123(調(diào)整至終濃度 1 mg·L-1)，37℃ 孵育 30 min，1 000 r·min-1離心5 min，PBS清洗2次。流式細胞儀檢測分析(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光波長525 nm)，檢測線粒體膜電位的變化。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-9的表達 40 g·L-1多聚甲醛固定細胞。實驗步驟按照PV6001免疫組織化學(xué)試劑盒說明進行，設(shè)空白對照(即用PBS代替一抗)。光鏡下觀察結(jié)果。Caspase-9陽性表達于RPE細胞漿中，呈大量特異性黃色著色。應(yīng)用OPTON VIDAS圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行分析，得到平均光密度值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，組內(nèi)各時間段間比較用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫對RPE細胞周期的影響 與正常對照組相比，過氧化氫作用6 h組RPE細胞處于靜止期(G0期)和合成前期(G1期)的細胞所占比率增高(P＜0.01)，呈G0/G1期阻滯現(xiàn)象，且隨作用時間的延長而增加，72 h時達到最高(P ＜0.01)，呈效應(yīng)-時間依賴性(表1)。

2.2 人RPE細胞線粒體膜電位的變化 流式細胞儀分析各組細胞羅凡明123的熒光強度，其熒光強度降低表明線粒體膜電位降低。與正常對照組比較，過氧化氫作用各時段細胞線粒體膜電位明顯降低。過氧化氫作用1 h，即可檢測到RPE細胞膜電位降低(P＜0.05)，且隨時間延長逐漸降低，呈效應(yīng)-時間依賴性(表1)。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測人RPE細胞Caspase-9的表達變化 在正常對照組，Caspase-9表達于細胞膜和細胞漿上，呈少量特異性淺黃色著色(圖1)。在不同時段的過氧化氫處理組，Caspase-9呈特異性棕黃色著色，且隨時間的延長而增強，24 h組達到高峰(圖2)，72 h組略有回落，但仍較正常對照組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

Figure 1 Expression of Caspases-9 protein in human RPE cells of normal group(DAB，×400) 正常對照組Caspase-9蛋白表達(DAB染色，×400)

Figure 2 Expression of Caspases-9 protein in human RPE cells of 24 hours group treated with H2O2(DAB，×400) 過氧化氫處理24 h組Caspase-9蛋白表達(DAB染色，×400)

3 討論

RPE細胞的損傷、衰老及死亡在AMD發(fā)病和病程發(fā)展中起到重要作用［3］。由于人RPE細胞在眼部的特殊位置和作用，導(dǎo)致其特別容易受到氧自由基的攻擊。隨著年齡的增長，蓄積性的氧化損傷導(dǎo)致人RPE細胞功能和結(jié)構(gòu)的異常，進而導(dǎo)致AMD等視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生［4］。

表1 過氧化氫作用不同時段G0/G1期細胞所占比率、線粒體膜電位以及Caspase-9的表達情況Table1 Changes of G0/G1cell ratio，mitochondrial membrane potential and Caspases-9 protein expression in RPE cells treated by H2O2in different time(±s，n=4)

表1 過氧化氫作用不同時段G0/G1期細胞所占比率、線粒體膜電位以及Caspase-9的表達情況Table1 Changes of G0/G1cell ratio，mitochondrial membrane potential and Caspases-9 protein expression in RPE cells treated by H2O2in different time(±s，n=4)

Note:Compared with normal control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

Group G0/G1cell ratio(%)Caspases-9 Normal control 71.20±0.24 121.20 ±0.54 3.2 ±0 Mean fluorescence intensity.2 H2O21 hour 71.37±0.15 112.37 ±0.65* 4.5 ±0.4*H2O26 hours 78.40±0.22＊＊ 96.67±0.52＊＊ 16.2±0.5＊＊H2O212 hours 82.43±0.27＊＊ 91.05±0.37＊＊ 28.5±0.9＊＊H2O224 hours 84.31±0.24＊＊ 73.36±0.44＊＊ 36.2±0.4＊＊H2O272 hours 89.12±0.21＊＊ 62.48±0.59＊＊ 26.4±0.8＊＊

細胞周期異常是反映細胞衰老的重要指標(biāo)，細胞衰老最顯著的特征是細胞阻滯于靜止期和DNA合成前期(G0/G1)，失去了對有絲分裂原的反應(yīng)能力和合成DNA的能力，不能進入有絲分裂期［5］。本研究通過流式細胞術(shù)測定RPE細胞周期，發(fā)現(xiàn)過氧化氫處理后，RPE細胞出現(xiàn)生長停滯，停留在靜止期和合成前期的細胞增多，并且隨過氧化氫作用時間的延長，生長停滯越發(fā)明顯，呈效應(yīng)-時間依賴性。進一步證明了過氧化氫長時間作用可以誘發(fā)體外培養(yǎng)的人RPE細胞的衰老。

近年來，細胞衰老的線粒體功能障礙研究成為國內(nèi)外研究衰老機制的一個熱點［6］。線粒體膜電位是由能量代謝過程中線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對稱性形成的跨膜電位，參與ATP的代謝過程，對于維持線粒體功能起到重要作用。本研究采用了國內(nèi)外常用的羅丹明123染色，流式細胞儀分析法檢測線粒體膜電位［7］。羅丹明123是親脂性陽離子熒光染料，線粒體膜電位正常的狀態(tài)下，羅丹明123進入線粒體呈強熒光，如果線粒體膜電位去極化則會減少對羅丹明123的攝取而導(dǎo)致熒光減弱。所以羅丹明123熒光的強弱反映了線粒體膜電位的變化。我們研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，過氧化氫作用1 h即可見RPE細胞線粒體膜電位降低，且隨時間延長逐漸降低，呈效應(yīng)-時間依賴性。由此可見，線粒體損傷是過氧化氫誘導(dǎo)RPE細胞衰老的早期事件，線粒體是RPE細胞氧化損傷的重要效應(yīng)細胞器。

線粒體膜電位降低的同時線粒體膜表面出現(xiàn)透過性轉(zhuǎn)運孔。多種凋亡因子會通過透過性轉(zhuǎn)運孔釋放到細胞質(zhì)中，形成級聯(lián)反應(yīng)，正反饋地促進凋亡因子的釋放，促使細胞凋亡［8］。Caspase-9是線粒體凋亡途徑中的核心上游因子［9］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)在不同時段的過氧化氫處理組，Caspase-9呈特異性棕黃色著色，隨時間的延長而增強，24 h達到高峰，72 h時表達有所降低。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫處理24 h可以引起體外培養(yǎng)的人RPE細胞凋亡達到高峰［2］。以上結(jié)果表明，Caspase-9介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑在RPE衰老過程中起到重要的作用。

綜上所述，過氧化氫氧化損傷導(dǎo)致了人RPE細胞生長停滯，細胞衰老。其機制與線粒體膜電位降低導(dǎo)致的線粒體代謝障礙和Caspase-9介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑有關(guān)。如何抑制RPE細胞的氧化損傷，穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)和功能，有待進一步的研究。

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