麻麗丹，王殿夫，于曉婕，吳 斌

（1.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000；2.遼東學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，遼寧 丹東 118000；3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065；4.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001）

近年來，由于河豚魚出口創(chuàng)匯價(jià)值較高，所以河豚魚的養(yǎng)殖面積正在迅速增多。河豚魚的生物學(xué)特性較常規(guī)養(yǎng)殖魚類復(fù)雜、特殊，且易受外界環(huán)境因子的影響，疾病發(fā)生率高。近幾年來在規(guī)?；绾宛B(yǎng)殖過程中病害日益嚴(yán)重，河豚疾病在河豚養(yǎng)殖過程中降低河豚養(yǎng)殖成活率、同時(shí)也降低了河豚外觀和品質(zhì)，從而影響了產(chǎn)品出口及其出口價(jià)格，對(duì)養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，河豚疾病成了限制其發(fā)展的主要因素[1]。

自2007年開始，遼寧地區(qū)一種由弧菌感染導(dǎo)致的腹面皮下充血發(fā)紅病癥時(shí)有發(fā)生，造成不同程度的死亡率，給該產(chǎn)業(yè)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失?；【且活愂澜绶秶鷥?nèi)廣泛分布的革蘭氏陰性桿菌，其中至少有12個(gè)種，如霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌等對(duì)人體有很強(qiáng)的致病性，常引起人體嚴(yán)重腹瀉和脫水，有時(shí)還出現(xiàn)傷口感染，中耳炎及敗血癥。弧菌也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常見、流行性最廣、危害最為嚴(yán)重的細(xì)菌性病原之一[2-4]，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，弧菌病的暴發(fā)越來越頻繁，傳播速度越來越快，給全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究從患病養(yǎng)殖河豚魚病灶處分離出11株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)致病菌為河弧菌和霍利斯弧菌，并對(duì)其一些生物學(xué)特性和敏感藥物進(jìn)行了測(cè)定，為養(yǎng)殖河豚疾病的防治提供依據(jù)，減小因河豚疾病造成的損失。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

患病河豚魚取自遼寧莊河和丹東東港的兩家河豚魚養(yǎng)殖場(chǎng)，患病河豚魚病癥為尾鰭基部、軀干部以及腹面出現(xiàn)斑點(diǎn)狀出血，隨著病情的發(fā)展，患部組織浸潤(rùn)呈出血性潰瘍，嚴(yán)重者，出血處病灶隨之發(fā)生膿瘍，形成皮下膿腫，吻端、鰭膜爛掉，肛門紅腫擴(kuò)張，并有黃色粘液流出。解剖發(fā)現(xiàn)病魚肝臟呈彌散性出血，腸壁和腹腔膜也有發(fā)炎充血現(xiàn)象，病魚脾臟時(shí)有腫大，失血呈粉紅色。

1.2 病原菌分離

無菌解剖病魚，分別取其體表病灶、鰓、肝和腎等組織少許，剪碎后在MA平板上劃線分離，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從平板上形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落中挑取單個(gè)菌落，重復(fù)進(jìn)行MA平板劃線3次，以獲得病菌的純培養(yǎng)。

1.3 人工感染實(shí)驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)用魚 試驗(yàn)用健康河豚魚共計(jì)48尾，按每個(gè)50L的塑料缸中放養(yǎng)3尾，暫養(yǎng)1周，水溫控制在（15±1）℃，確認(rèn)無病后開始試驗(yàn)。

1.3.2 菌懸液制備 將純培養(yǎng)菌株接種于新鮮TSA瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗下菌落，制成菌懸液，以麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ频?×108/mL濃度的菌懸液。

1.3.3 攻毒試驗(yàn) 將每缸設(shè)為一組，共11組分別用于所分離的11株菌（從養(yǎng)殖場(chǎng)患有明顯弧菌病病癥魚中分離的優(yōu)勢(shì)菌株）的攻毒試驗(yàn)，體壁肌肉注射健康河豚魚（每尾0.1mL），每組設(shè)平行試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，注射等量無菌0.85%生理鹽水。

1.4 病原菌分離鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 純培養(yǎng)的細(xì)菌于30℃培養(yǎng)24 h后，按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色和顯微鏡觀察。

1.4.2 生理生化測(cè)定 采用法國(guó)梅里埃公司的API-20E鑒定系統(tǒng)并結(jié)合傳統(tǒng)的手工鑒定方法對(duì)純培養(yǎng)24 h的菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)試。細(xì)菌的生理生化特征實(shí)驗(yàn)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]和《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》（第九版）[6]進(jìn)行。

1.4.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，toxR基因首先是作為霍亂毒素操縱子的調(diào)控基因而被發(fā)現(xiàn)，隨后被發(fā)現(xiàn)它也是霍亂弧菌許多其它基因的調(diào)控基因。研究發(fā)現(xiàn)toxR基因在弧菌中普遍存在而不同種之間同源性程度卻又較低，霍亂弧菌和副溶血性弧菌之間為52%，所以我們選擇了toxR基因作為檢測(cè)靶基因。與GenBank等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的所有物種核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果，以及生物信息學(xué)方法證明，該基因在河弧菌內(nèi)高度保守，而相對(duì)于其它物種則具有高度特異性。結(jié)合文獻(xiàn)研究成果，以toxR基因?yàn)樵O(shè)計(jì)目標(biāo)，設(shè)計(jì)的引物探針經(jīng)BLAST驗(yàn)證具有高度保守性，特異性強(qiáng)。所用引物和探針見表1所列。

表1 河弧菌實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)所用引物和探針序列

采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA，并對(duì)提取DNA作為反應(yīng)模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。本研究按照試劑廠家推薦的反應(yīng)程序，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)和特異性試驗(yàn)。

1.5 藥物敏感試驗(yàn)

藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，共15種抗菌藥物，藥敏試驗(yàn)參照紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 人工感染實(shí)驗(yàn)

用菌株M1～M11通過體壁肌肉注射方式感染實(shí)驗(yàn)組，感染M1、M3～M5、M7～M9和M11的河豚魚在20 d內(nèi)仍健康，無發(fā)病癥狀，而感染M2、M6和M10的河豚魚均在15 d內(nèi)全部死亡，從所有死亡的魚中都分離出了與注射菌株特性一致的菌株，因此可認(rèn)為死亡是由注射菌株感染造成的。死亡魚與自然狀態(tài)下急性感染的病魚癥狀相似，表現(xiàn)為腹面肌肉充血發(fā)紅；腎臟有腫大、灰白色膿樣壞死灶；肝臟充血，腹腔膜和腸壁發(fā)生充血炎癥。對(duì)照組無死亡現(xiàn)象。

2.2 病原菌的分離鑒定

2.2.1 形態(tài)及生理生化鑒定 選取菌株M2、M6和M10，對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定，3株菌株均為革蘭氏陰性；彎曲短桿菌；粘絲試驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性。鑒定結(jié)果見表2，結(jié)果均為為河弧菌。

表2 菌株M2、M6和M10生理生化特征的比較

2.2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果:均出現(xiàn)了典型的擴(kuò)增曲線（圖1），表明為河弧菌。

2.3 藥物敏感試驗(yàn)

利用紙片法測(cè)定15種抗菌藥物對(duì)菌株M2和M6的作用效果見表3。15種藥物的敏感性試驗(yàn)證實(shí)兩菌株均對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星較為敏感，對(duì)頭孢類藥物具有耐藥性。

表3 河弧菌對(duì)不同抗菌藥物的敏感性

3 討論

3.1 海洋弧菌是海洋生物體表和體內(nèi)微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，在世界各沿海地區(qū)，因?yàn)槭秤煤ｕr尤其是貝類造成人類消化道等疾病的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此，弧菌對(duì)人類健康的危害受到人們廣泛的重視，世界各國(guó)對(duì)于海產(chǎn)品的進(jìn)出口以及食品衛(wèi)生檢疫都有相當(dāng)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌對(duì)人類具有致病性，可以導(dǎo)致人類發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉等消化道疾病、創(chuàng)傷感染或敗血癥。1994年出版的《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》（第9版）列舉了12種與人類臨床疾病有關(guān)的弧菌。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)河豚疾病的深入研究幾乎為零，國(guó)內(nèi)僅有少量關(guān)于河豚疾病防治的經(jīng)驗(yàn)介紹?；【撬a(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的病原菌之一，如養(yǎng)殖刺參潰瘍病和斑節(jié)對(duì)蝦弧菌病[7]等。水產(chǎn)養(yǎng)殖中多次大面積流行的弧菌病原都來自于水體，可以推測(cè)水體是一個(gè)天然的弧菌毒力基因的保存庫(kù)，通過船舶的壓艙水與水產(chǎn)品的進(jìn)出口等多種途徑很容易造成毒力基因的地域性轉(zhuǎn)移，從而可能使當(dāng)?shù)氐哪承o毒株轉(zhuǎn)變?yōu)橹匾挠卸局?，可能是不斷出現(xiàn)弧菌新病原菌的重要原因之一。

3.2 對(duì)大部分水生環(huán)境中的弧菌如溶藻弧菌、河弧菌、霍利斯弧菌、鯊魚弧菌、弗氏弧菌等的研究明顯不足。它們的毒力基因與病原性資料不足的現(xiàn)狀不利于揭開這些未被重視的環(huán)境病原種（株）的致病機(jī)理，也無法發(fā)現(xiàn)這些種類對(duì)弧菌進(jìn)化的真正貢獻(xiàn)及現(xiàn)有毒力基因的演化來源，同時(shí)也明顯阻礙了這些弧菌的株型分類與鑒定。因此開展各地環(huán)境，特別是水生環(huán)境中弧菌毒力基因及其多樣性研究，發(fā)展毒力基因檢測(cè)與毒力菌株的鑒定方法顯得非常重要，只有這樣才能及時(shí)有效地預(yù)防弧菌傳染病的大面積暴發(fā)[8]。

本實(shí)驗(yàn)從病原學(xué)方面對(duì)河豚魚皮下充血病做了基礎(chǔ)性研究，并對(duì)病原菌的敏感性藥物進(jìn)行了篩選，有助于指導(dǎo)河豚魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

[1]竇海鴿，劉彥，王亞軍.河豚養(yǎng)殖中幾種常見疾病及防治技術(shù)[J].北京水產(chǎn)，2004，5（3）:26-28.

[2]陶保華，胡超群，吳蔚.斑節(jié)對(duì)蝦弧菌病的病原生物學(xué)研究[J].熱帶海洋學(xué)，2001，20（2）:80-87.

[3]陶保華，胡超群，任春華.海水魚類病原弧菌對(duì)對(duì)蝦的致病力及其疫苗的免疫預(yù)防作用 [J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2001，20（4）:68-73.

[4]陳償，胡超群，張呂平，等.用RAPD 技術(shù)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境溶藻弧菌遺傳多樣性的研究[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2002，21（4）:49-54.

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