高以明 ，張敬友 ，王水明 ，柯家法 ，李超美 ，朱雪良 ，張 揚(yáng) ，嚴(yán)繼寧 ，黃立業(yè) ，任曉進(jìn) ，吳艷濤 ，劉文博

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095；2.南京出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001；3.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001；4.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

鴿新城疫又稱鴿Ⅰ型副黏病毒病，是由新城疫病毒（又稱鴿副黏病毒Ⅰ型）引起的一種急性高度接觸性敗血性傳染病，以腸炎、嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征[1-3]，其發(fā)病率為50%～100%，病死率達(dá)20%～95%。該病于1977年發(fā)生在中東地區(qū)，次年在埃及和伊拉克發(fā)生[1]。隨后迅速傳播到歐洲、美國、加拿大等地，1985年傳播到亞洲[4-6]。1986年前后我國的鴿群中也發(fā)現(xiàn)了該病[7]，現(xiàn)全國各省市均有報(bào)道[8-13]。

早期對(duì)鴿新城疫病毒的研究發(fā)現(xiàn)，鴿源新城疫病毒與當(dāng)時(shí)雞源新城疫病毒抗原性和生物學(xué)特性有一定的差異[1，14-15]，基因型主要是Ⅵb 亞型[6，16-17]，對(duì)雞的致病性與雞源新城疫病毒不同[3，5，8，21]，然而，隨著時(shí)間的推移、禽類養(yǎng)殖方式和規(guī)模等的改變，鴿源新城疫病毒也出現(xiàn)了一定的變化[18-23]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)從臨診病例中分離到的兩株鴿源新城疫病毒進(jìn)行了毒力測(cè)定和基因型分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒和其他生物材料 兩個(gè)鴿源NDV分離株是按照國際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的方法[24]在2008年從臨床鴿病例中分離，命名JS-1-08-Pi和JS-2-08-Pi；SPF雞胚購自山東家禽研究所SPF雞場(chǎng)。

1.2 主要試劑 禽成髓細(xì)胞病毒反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）購自 TOYOBO 公司；200 bp DNA Marker、DNA 凝膠回收試劑盒、dNTP購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I為MBI公司產(chǎn)品；pCR2.1 載體、Trizol、DH5α 大腸桿菌為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；Ampicilin、X-gal、IPTG 購自Sigma公司；DEPC購自BBI公司。

蛋白胨和酵母抽提物購自英國OXOID公司；瓊脂粉瓊脂糖為西班牙產(chǎn)品；醋酸鈉（NaAc）、十二烷基磺酸鈉（SDS）系Sigma公司產(chǎn)品；三氯甲烷（氯仿）、異丙醇、異戊醇、乙酸鉀、冰乙酸和三羥基甲基氨基甲烷等常規(guī)試劑購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；飽和酚為南京生物工程公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 PTC-200型PCR儀、3000XI型電泳儀購自美國BIO-RAD公司；恒溫金屬水浴鍋CHB-100型購自杭州大和熱磁電子有限公司；RC232C型紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式高速離心機(jī)購自德國eppendorf公司；純水儀Milli-Q低熱原型購自美國Millipore公司。

1.4 引物 參照已發(fā)表的NDV毒株基因的核苷酸序列，應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，P1和P2擴(kuò)增M基因1161 nt至F基因889 nt間長約970 pb的片段，P3和P4擴(kuò)增F基因862 nt至F基因1700 nt間長約839 bp的片段。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為:

1.5 病毒毒力的測(cè)定 按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）介紹的方法進(jìn)行[24]。

1.6 病毒RNA的提取和cDNA的合成 NDV毒株的RNA抽提按照Trizol試劑說明書進(jìn)行。cDNA的合成按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[17]。

1.7 NDV F基因的克隆 F基因的RT-PCR擴(kuò)增按有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[17]。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選陽性克隆。

1.8 序列測(cè)定和推導(dǎo)氨基酸序列分析 篩選出的F基因陽性克隆寄送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)定核苷酸序列，用DNAStar 5.0版本軟件包的軟件（DNASTAR Inc.Madison，WI153715，USA）分析F基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。

1.9 NDV系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分布分析 參考已報(bào)道的方法[16-17]，根據(jù)F基因47nt～420 nt之間的374 bp片段的核苷酸序列繪制NDV系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹，同時(shí)分析F基因334nt～1682nt之間的1349 bp片段上HinfⅠ、BstOⅠ和RsaⅠ三種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 病毒毒力的測(cè)定結(jié)果 2株新城疫病毒毒株，經(jīng)毒力檢測(cè)測(cè)得雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）分別為48h和46 h，8周齡SPF雞靜脈接種指數(shù)（IVPI）分別為2.88和2.91，一日齡雛雞腦內(nèi)接種指數(shù)（IPCI）分別為1.88和1.89，均判定為強(qiáng)毒株。

2.2 NDV F基因片段的擴(kuò)增、克隆 該毒株經(jīng)RT-PCR均擴(kuò)增出了大小為970 pb和839 bp的特異性條帶。

2.3 NDV F基因序列測(cè)定和序列分析

2.3.1 NDV F基因序列測(cè)定和推導(dǎo)氨基酸序列分析

根據(jù)測(cè)得的F基因核苷酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)編碼氨基酸，蛋白酶裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列為112R（K）RQKR↓F117，符合NDV強(qiáng)毒株的規(guī)律[25]。

2.3.2 NDV系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分布

用DNAStar軟件對(duì)2個(gè)鴿源分離株和28個(gè)參考毒株的F基因47 nt～420 nt區(qū)域進(jìn)行比較，繪制了系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹（圖1）。結(jié)果顯示，兩個(gè)毒株分布在一個(gè)分支上，為基因Ⅶ型。

F基因334 nt～1682 nt間三種限制性內(nèi)切酶（HinfⅠ、BstOⅠ和RsaⅠ）位點(diǎn)分布是基因分型的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。本文中所分離到的鴿源NDV分離株歸于Ⅶ型，它們具有特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分布。在736nt，883nt具有 HinfⅠ位點(diǎn)，而在 1198 nt，1350 nt不具有 HinfⅠ位點(diǎn)，在 752 nt，1116 nt具有 HinfⅠ位點(diǎn)，而在 953 nt，1478 nt、1601 nt不具有 HinfⅠ位點(diǎn)，在 872 nt，973 nt、1249 nt具有 HinfⅠ位點(diǎn)，而在540 nt，683 nt、1593 nt、1625 nt不具有 HinfⅠ位點(diǎn)。

3 討論

從臨床病鴿體內(nèi)分離到了2株NDV，毒力測(cè)定結(jié)果表明，2株新城疫病毒毒株的MDT分別為46 h和 48 h，IVPI分別為 2.88和 2.91，IPCI分別為 1.88和1.89，按照OIE推薦的標(biāo)準(zhǔn)為強(qiáng)毒株。F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸推導(dǎo)序列為112R（K）RQKR↓F117，符合強(qiáng)毒株的分子特征。遺傳發(fā)生分析表明這兩個(gè)毒株與同期其它禽群中發(fā)生新城疫的毒株親緣關(guān)系很近。

早期研究表明鴿源新城疫病毒抗原性和基因型均有一定的特征，單抗分排譜屬于P組[14]，基因型屬于Ⅵb亞型[16]。1996年我國承辦國際信鴿比賽后，排出的病毒使得大范圍ND流行。國內(nèi)不少學(xué)者對(duì)病原進(jìn)行了分離和研究。劉文斌等分離到一株鴿源NDV，為基因Ⅵ型[26]。韋平等分離到一株鴿源毒株gxp22也為Ⅵb亞型[27]。劉華雷等分到5株鴿源毒株基因型也為基因Ⅵ型[28]。而本文中分離到的毒株屬于Ⅶc亞型。這表明Ⅶc亞型NDV在鴿群中存在，這與以往經(jīng)典Ⅵb亞型毒株占優(yōu)勢(shì)相比出現(xiàn)了新的變化。

對(duì)于鴿源新城疫病毒毒力的研究表明，與OIE推薦的標(biāo)準(zhǔn)以及裂解位點(diǎn)氨基酸序列標(biāo)準(zhǔn)不一致。于守平報(bào)道了2004年12月份吉林省肉鴿一例NDV，并分離到了一株強(qiáng)毒株[13]。連宏軍等從黑龍江發(fā)病鴿場(chǎng)分離了兩株NDV，經(jīng)毒力鑒定為強(qiáng)毒株[29]。梁華麗從發(fā)病鴿分離出的NDV為弱毒[30]。韋平等分離到的鴿源毒株gxp22裂解位點(diǎn)氨基酸序列為強(qiáng)毒序列，而IVPI為0[27]。劉華雷等報(bào)道的5株鴿源毒株裂解位點(diǎn)氨基酸序列為強(qiáng)毒序列，但未進(jìn)行毒力的測(cè)定[28]。李檸等和謝青梅等人的報(bào)道也表明鴿源毒株對(duì)雞的致病力差異很大[31-32]。Dortmans J C等人2009年的一篇報(bào)道表明鴿源毒株裂解位點(diǎn)氨基酸序列并不總與毒力相關(guān)[33]。（2002我們分離的一株鴨源NDV裂解位點(diǎn)氨基酸序列為典型強(qiáng)毒序列，但I(xiàn)VPI為0，未發(fā)表。）本文中分離到的兩株鴿源新城疫病毒毒力均較高，且裂解位點(diǎn)氨基酸序列為強(qiáng)毒。以上研究都表明我國鴿群中新城疫病毒的毒力和生物學(xué)特性存在較大差異。

從發(fā)病禽分離到的病毒按照OIE推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)鑒定為弱毒的病毒毒株，這說明不同的新城疫毒株對(duì)不同宿主的致病力有一定差異。完全用對(duì)NDV非常敏感的雞作為新城疫毒株的唯一試驗(yàn)宿主可能會(huì)影響對(duì)新城疫病毒毒力正確的判定。

我國鴿的飼養(yǎng)量越來越大，除肉鴿外，信鴿、賽鴿等一些名貴的鴿種也越來越多，隨著養(yǎng)殖量增加和規(guī)模擴(kuò)大，疫病防控的難度也隨之加大。而由于其它野生禽類，家養(yǎng)禽類可能的帶毒排毒狀態(tài)，會(huì)加大養(yǎng)鴿的風(fēng)險(xiǎn)。建立不同禽類新城疫病毒監(jiān)測(cè)體系，對(duì)該病的分子流行病學(xué)和病原變異進(jìn)行監(jiān)控，對(duì)于控制新城疫在我國禽群和其它動(dòng)物群內(nèi)的傳播有著非常重要的意義。因此，對(duì)臨診分離到的病毒進(jìn)行病原體的生物學(xué)特征和遺傳變異進(jìn)行監(jiān)測(cè)對(duì)該病的防控十分重要。

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