韓 強(qiáng)，潘桂玲，張永文

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇 徐州 221002

蘭索拉唑是由日本武田公司開發(fā)的H+/K+-ATP酶抑制劑，于1991年首次在法國上市，主要用于胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合口潰瘍及反流性食管炎、卓－艾綜合征的治療[1]。與奧美拉唑相比，由于蘭索拉唑的吡啶環(huán)4-位引入了三氟乙氧基，使得其具有更好的療效、較少的副作用和更強(qiáng)的穩(wěn)定性[2]。在胃潰瘍狀態(tài)下，生理及病理上的變化，必將影響藥物的藥代動力學(xué)行為。現(xiàn)有的蘭索拉唑的藥代動力學(xué)研究報(bào)道，尚無在胃潰瘍病家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究報(bào)道[3-5]。因此本實(shí)驗(yàn)建立了測定血漿中蘭索拉唑的高效液相色譜法，并采用此方法研究了該藥在正常及潰瘍兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，為臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 動物

家兔，體重(2.5±0.2)kg，雌雄各半，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供（SYXK(蘇)2001-0050）。

1.2 儀器

Shimadzu LC-10A高效液相色譜儀（日本島津制作所），包括SCL-10Avp系統(tǒng)控制器，SPD-M20A二極管陣列檢測器，LC-10ADvp兩元泵，SIL-20A自動進(jìn)樣器，F(xiàn)CV-10Alvp四元低壓梯度洗脫系統(tǒng)，DGU-20As在線脫氣機(jī)，島津Lcsolution色譜數(shù)據(jù)工作站。梅特勒托利多AE240電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler Toledo)；臺式高速冷凍離心機(jī)（5417R，德國 Eppendorf公司）。

1.3 藥品與試劑

注射用蘭索拉唑 （江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，批號：090501，規(guī)格：30 mg/支）；蘭索拉唑?qū)φ掌罚〒P(yáng)州市三藥制藥有限公司提供，批號：20080605，純度＞99.0%）；奧美拉唑?qū)φ掌罚ńK奧賽康藥業(yè)有限公司提供，批號：0908005，純度＞99.0%）；甲醇、乙腈為色譜純；二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醚、無水碳酸鈉為分析純；水為去離子水。

1.4 供試樣品及對照品溶液的制備

1.4.1 蘭索拉唑注射液將30 mg/支注射用蘭索拉唑用10 mL 0.9%氯化鈉注射液稀釋，取1 mL稀釋液加入99 mL生理鹽水中，備用。

1.4.2 對照品溶液精密稱取蘭索拉唑?qū)φ掌?.16 mg置5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成1.03 mg·L-1的蘭索拉唑?qū)φ掌啡芤骸?/p>

1.4.3 蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液精密稱取蘭索拉唑5.16 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.03 mg·L-1蘭索拉唑的儲備液。臨用前用流動相 56%甲醇稀釋成為 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱 4℃冷藏保存，待用。

1.4.4 內(nèi)標(biāo)溶液精密稱取奧美拉唑?qū)φ掌?.18mg置5 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成1.03mg·L-1的奧美拉唑儲備液，并稀釋成10.0μg·mL-1作為內(nèi)標(biāo)濃度。

1.5 動物實(shí)驗(yàn)方案及血漿樣品處理方法

1.5.1 動物實(shí)驗(yàn)方案健康家兔12只，雌雄各半，體重（2.5±0.2）kg。禁食24 h后，其中6只綁于兔臺上置于20℃水中，水量漫過兔的胸骨，8 h后取出吹干。待家兔可以自由活動后，耳緣靜脈給藥，控制在30 min左右滴注完畢，給藥前及給藥后5、10、15、20、30、45、60、75、90、120、150、210、270、390 min 頸總動脈取血2 mL，根據(jù)實(shí)際情況補(bǔ)充適量生理鹽水。將全血置于肝素處理過的試管中3000 r·min-1離心10 min，分取血漿，-20℃冷凍保存，待測。

1.5.2 血漿樣品處理方法精密量取離心后的血漿500 μL，至離心管中，精密加入 50 μL 10.0 μg·mL-1奧美拉唑內(nèi)標(biāo)溶液，混勻。加入200 μL 0.1 mol·L-1碳酸鈉,渦旋混勻30 s，再加入2 mL乙腈，渦旋混勻2 min，于 4000 r·min-1離心 10 min。 取有機(jī)層 45℃下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL流動相溶解，于14000 r·min-14℃離心10 min。取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

1.6 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱 (大連依利特有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(56︰44，v/v)；檢測波長：284 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量 20 μL；流速 0.8 mL·min-1。

1.7 數(shù)據(jù)處理

藥代動力學(xué)參數(shù)的估算按中國藥理學(xué)會推薦的藥代動力學(xué)程序“DAS2.0”對血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行自動擬合，根據(jù)AIC進(jìn)行房室模型判別，參數(shù)AUC(0-t)、AUC0-∞、t1/2、MRT(0-t)、CL、V 等分別作方差分析及雙側(cè)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性在上述色譜條件下檢測空白血漿、模擬血漿樣品和家兔給藥后血漿樣品，蘭索拉唑的保留時(shí)間為19.9 min，內(nèi)標(biāo)奧美拉唑的保留時(shí)間為13.3 min。血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾蘭索拉唑和內(nèi)標(biāo)的測定。色譜圖見圖1。

2.1.2 線性關(guān)系取兔空白血漿0.5 mL，精密加入7個不同質(zhì)量濃度的蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，按“1.5.2”項(xiàng)血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，使其含蘭索拉唑濃度為 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿，每種濃度做兩份。在“1.6”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖、蘭索拉唑峰面積（As）及內(nèi)標(biāo)奧美拉唑峰面積（Ar）。以蘭索拉唑?qū)W美拉唑峰面積平均值的比值（As/Ar）對蘭索拉唑血藥濃度（C）作回歸計(jì)算，得回歸方程As/Ar=0.0016C+0.0438（權(quán)重系數(shù) w=1/y）。結(jié)果表明，蘭索拉唑在 0.02～2.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，其峰面積與內(nèi)標(biāo)奧美拉唑峰面積的比值與蘭索拉唑濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r2=0.9981）。

2.1.3 定量下限本方法蘭索拉唑的定量下限（LLOQ）為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度 0.02 μg·mL-1，且連續(xù)3次測定結(jié)果的準(zhǔn)確度及精密度均符合生物樣品測定方法的要求，見表1。

2.1.4 回收率考察

2.1.4.1 絕對回收率 精密量取不同濃度的蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，加入內(nèi)標(biāo)奧美拉唑100 μL，再加入200 μL流動相，渦旋混勻，配成含蘭索拉唑濃度分別為低、中、高（0.1、0.5、1.6 μg·mL-1）的溶液，每種濃度各做3份樣品，精密吸取20 μL上清液進(jìn)樣分析。記錄色譜圖，測定蘭索拉唑與內(nèi)標(biāo)奧美拉唑的色譜峰面積(As與Ar)。

精密量取不同濃度的蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿 0.5 mL， 制備 0.1、0.5、1.6 μg·mL-1的血漿，每種濃度各做3份樣品。每份按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下“精密加入 50 μL 10.0 μg·mL-1奧美拉唑內(nèi)標(biāo)溶液”起操作。記錄色譜圖，測定蘭索拉唑與內(nèi)標(biāo)奧美拉唑的色譜峰面積(As1與Ar1)，對上述As1、Ar1與 As、Ar按 As1/As×100%計(jì)算，即為蘭索拉唑的絕對回收率（R）。結(jié)果表明，蘭索拉唑的高中低濃度回收率均大于75%。

2.1.4.2 相對回收率 對“絕對回收率”中得到的As1、Ar1與 As、Ar按(As1/Ar1)/(As/Ar)×100%計(jì)算，即得各濃度“血漿樣品處理方法”的相對回收率，結(jié)果表明，蘭索拉唑的高中低濃度相對回收率均大于80%。

2.1.5 精密度考察精密量取不同濃度的蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿0.5 mL，制備0.1、0.5、1.6 μg·mL-1的血漿，每種濃度各做 5 份樣品。每份按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下“精密加入50μL 10.0μg·mL-1奧美拉唑內(nèi)標(biāo)溶液”起操作。在批內(nèi)和批間（連續(xù)5天）對每種濃度各做5份樣品，記錄色譜圖，記下蘭索拉唑峰面積（As）對奧美拉唑峰面積（Ar），用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蘭索拉唑的濃度。求得批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果見表2，其表明血漿樣品分析的精密度良好，RSD均小于10%。

表2 HPLC法的批內(nèi)和批間變異 (±s，n=5)

表2 HPLC法的批內(nèi)和批間變異 (±s，n=5)

2.1.6 穩(wěn)定性考察

血漿樣品處理后室溫放置穩(wěn)定性 精密量取蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿0.5 mL，制備低、中、高3個不同濃度水平的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下“精密加入 50 μL 10.0 μg·mL-1奧美拉唑內(nèi)標(biāo)溶液”起至 “于14000 r·min-14℃離心10 min”止操作后，各濃度每2份一組在室溫下分別放置 0、12、24 h 后取上清液 20 μL 進(jìn)樣分析，測定各組分濃度，計(jì)算血藥濃度變異系數(shù)。結(jié)果表明按實(shí)驗(yàn)方法處理后蘭索拉唑血漿樣品在室溫下是穩(wěn)定的，RSD均小于10%。

血漿樣品冷藏放置穩(wěn)定性 精密量取蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，加入空白血漿0.5mL，制備低、中、高3個不同濃度水平的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下“精密加入50μL 10.0ng·mL-1奧美拉唑內(nèi)標(biāo)溶液”起至“于14000r·min-14℃離心10min”止操作后，各濃度每2份一組置4℃冰箱中保存，分別在0、4、7天后取20 μL進(jìn)樣。測定各組分濃度，計(jì)算血藥濃度變異系數(shù)。結(jié)果表明按實(shí)驗(yàn)方法處理后蘭索拉唑血漿樣品在4℃下冷藏是穩(wěn)定的，RSD均小于10%。

血漿樣品凍融穩(wěn)定性 精密量取蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，加入空白血漿0.5 mL，制備低、中、高3個不同濃度水平的血漿樣品，每2份一組在-20℃下分別凍融1次、2次、3次后按“血漿樣品處理”項(xiàng)下 “精密加入 50 μL 10.0 μg·mL-1奧美拉唑內(nèi)標(biāo)溶液”起操作。結(jié)果表明血漿中蘭索拉唑在-20℃下反復(fù)凍融是穩(wěn)定的，RSD均小于10%。

2.2 蘭索拉唑在正常及潰瘍模型家兔體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

將蘭索拉唑注射液分別給予正常及潰瘍模型家兔耳緣靜脈滴注，按“1.5.1”項(xiàng)下采血方案進(jìn)行試驗(yàn)，血漿樣本處理方法按“1.5.2”項(xiàng)下進(jìn)行，血藥濃度按照“2.1.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見表3，蘭索拉唑平均血藥濃度對時(shí)間曲線見圖2。

表3 正常及潰瘍模型家兔靜脈滴注蘭索拉唑后血漿中的藥物濃度（±s，n=6）

表3 正常及潰瘍模型家兔靜脈滴注蘭索拉唑后血漿中的藥物濃度（±s，n=6）

（注：0表示藥物濃度低于最低檢測限）

圖2 正常及潰瘍模型家兔靜脈給予蘭索拉唑后平均藥時(shí)曲線

根據(jù)AIC進(jìn)行房室模型判別，結(jié)果表明蘭索拉唑在潰瘍兔體內(nèi)藥代動力學(xué)行為符合二室模型，故采用“DAS2.0”軟件按二室模型進(jìn)行擬合，求得正常及潰瘍兔靜脈滴注蘭索拉唑后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4（按矩量法求得）。

表4 正常及潰瘍模型家兔靜脈給予蘭索拉唑后藥代動力學(xué)參數(shù) (±s,n=6)

表4 正常及潰瘍模型家兔靜脈給予蘭索拉唑后藥代動力學(xué)參數(shù) (±s,n=6)

（與正常組比較：*P＜0.05）

由表4可見，分析時(shí)間內(nèi)蘭索拉唑在潰瘍模型家兔體內(nèi)AUC明顯升高（P＜0.05），蘭索拉唑在潰瘍模型家兔體內(nèi)平均滯留時(shí)間延長，代謝速度減慢，血漿清除亦減慢（MRT(0-t)、t1/2、tmax、CL 及 Cmax和正常組比較P均＜0.05），提示胃潰瘍病理狀態(tài)影響蘭索拉唑的藥代動力學(xué)行為。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘭索拉唑在潰瘍模型家兔體內(nèi)過程發(fā)生了顯著變化，其體內(nèi)AUC(0-6.5)明顯增加，體內(nèi)平均滯留時(shí)間顯著延長，血漿消除半衰期顯著增大，血漿清除率顯著減小，推測可能是在胃潰瘍病狀態(tài)下，體內(nèi)肝藥酶體系發(fā)生了改變，導(dǎo)致蘭索拉唑代謝減慢。

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測定蘭索拉唑兔血漿藥物濃度的方法，樣品前處理方法簡單,分析方法的靈敏度、選擇性、精密度和定量分析線性關(guān)系均良好,符合生物樣品分析測定要求。應(yīng)用本試驗(yàn)所建立的分離、檢測方法測定正常及潰瘍兔體內(nèi)蘭索拉唑的血藥濃度，計(jì)算其主要藥動學(xué)參數(shù)，闡明了蘭索拉唑在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)過程，為臨床藥物濃度監(jiān)測提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),提高用藥的安全性。

[1] 沈海蓉，李中東，鐘明康.新型抗真菌藥蘭索拉唑[J].中國新藥與臨床雜志，2004，23(5):3081.

[2] 劉學(xué)峰，蔣軍榮，陳建軍.蘭索拉唑合成路線圖解[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35(10):635-7.

[3] Dugger HA,Carlson JD,Henderson W,et al.Bioequivalence evaluation of lansoprazole 30-mg capsules(Lanfast and Lanzor)in healthy volunteers[J].Eur J Pharmacol Biopharm,2001,51(2):153-7.

[4] D.Vijaya Bharathi,Kishore Kumar Hotha.Simultaneous estimation of four proton pump inhibitors-lansoprazole,omeprazole,pantoprazole and rabeprazole:development of a novel generic HPLC-UV method and its application to clinical pharmacokinetic study[J].Biomed.Chromatogr,2009,23(9):732-9.

[5] 曾曉暉，石 磊，羅新根，等.反相高效液相色譜法測定人血漿中蘭索拉唑的濃度[J]. 中國藥師，2006，9（9）:823.