鎖耀宇,楊衛(wèi)東,馬曉偉,汪 靜

(第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,陜西 西安 710032)

以腫瘤血管作為靶點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行靶向性研究是腫瘤診斷和治療的一個(gè)重要策略。含有特異序列的多肽RGD和NGR等是針對(duì)腫瘤血管的特異性配體,目前已成為腫瘤靶向性研究的熱點(diǎn)。

腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2],腫瘤新生血管的形成受CD13、αvβ3整合素(Integrin)等多種蛋白分子的調(diào)控。αvβ3整合素在多種腫瘤細(xì)胞表面和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)[3-4],含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的多肽能與αvβ3高度特異性結(jié)合。放射性核素標(biāo)記RGD多肽用于腫瘤顯像和治療的研究已有多篇報(bào)道[5-7]。CD13(氨肽酶N)是一種跨膜蛋白酶。研究表明,與αvβ3整合素一樣,CD13表達(dá)于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞,在正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)[8]。因此CD13可以作為腫瘤靶向性研究的一個(gè)理想靶位。NGR是應(yīng)用噬菌體隨機(jī)多肽庫(kù)技術(shù)篩選的一個(gè)核心序列為天冬酰胺(Asparagine,N)、甘氨酸(Glycine,G)、精氨酸(Arginine,R)的多肽,能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD13特異結(jié)合[9]。因此,國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者將NGR作為載體與腫瘤壞死因子(TNF)、脂質(zhì)體、血管形成抑制因子以及干擾素等多種藥物耦聯(lián)進(jìn)行腫瘤顯像、治療以及療效評(píng)價(jià)的研究[10-13]。研究[14-15]表明,以腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞CD13為靶點(diǎn),能夠明顯提高藥物的靶向性和抗腫瘤效果。188Re半衰期短,可發(fā)射穿透距離短、具有適宜治療的β射線(xiàn)和適于顯像的γ射線(xiàn),且制備簡(jiǎn)易可行,可作為腫瘤放免導(dǎo)向治療核素[16-17]。本工作擬制備15肽的188Re-NGR,并研究其在荷HepG2肝癌細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)裸鼠模型體內(nèi)的生物分布和SPECT顯像。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑和儀器

NGR:純度＞98%,西安第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心制備;二巰基乙醇:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;SnCl2·2H2O、葡萄糖酸鈉:北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

188W-188Re發(fā)生器:原子高科股份有限公司產(chǎn)品;GF254層析硅膠板、Sep-Pak C18反相萃取柱:美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;Mini-Scan型放射性薄層掃描儀:美國(guó)Bioscan公司產(chǎn)品;單道γ計(jì)數(shù)儀:西安志達(dá)科技有限公司產(chǎn)品;SPECT/CT:德國(guó)西門(mén)子公司產(chǎn)品。

HePG2肝癌細(xì)胞株:上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)裸鼠:約30 g,30只,清潔級(jí),4～6周齡,中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 188Re-NGR的制備

[18]的方法,并略加改動(dòng)制備得到188Re-NGR。NGR的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖 1,188Re-NGR制備流程示于圖2。具體方法為:在40μg NGR中加入二巰基乙醇(二巰基乙醇與NGR摩爾濃度比約為1 000∶1),混勻后室溫放置 30 min,加入200μL 0.2 mol/L p H 6.0的醋酸鈉緩沖液,5 mg葡萄糖酸鈉溶液,30μL氯化亞錫溶液(3.0 g/L,0.1 mol/L HCl溶解)和37 MBq Na188ReO4溶液,混勻,室溫下放置2 h,完成標(biāo)記。

2.2 188Re-NGR的標(biāo)記率及放化純度的測(cè)定

用薄層層析法(TLC)測(cè)定188Re-NGR標(biāo)記率。采用GF254層析硅膠板作為固定相,分別以丙酮、生理鹽水、V(乙醇)∶V(水)∶V(氨水)=2∶5∶1為流動(dòng)相展開(kāi)。根據(jù)不同展開(kāi)體系中所得到各標(biāo)記物放射性計(jì)數(shù),分別以下式計(jì)算標(biāo)記率及標(biāo)記物比活度:標(biāo)記率=[(188Re-NGR+188Re-膠體+188Re-配體)放射性計(jì)數(shù)/總放射性計(jì)數(shù)]×100%-(188Re-膠體+188Re-配體)放射性計(jì)數(shù)/總放射性計(jì)數(shù)×100%;比活度(PBq/g)=188ReO4-放射性活度(TBq)×標(biāo)記率÷NGR質(zhì)量(mg)。

標(biāo)記物經(jīng)Sep-Pak C18柱進(jìn)行純化后,TLC法測(cè)定放化純度。Sep-Pak C18柱純化:用10 mL蒸餾水飽和Sep-Pak C18柱,并用10 mL無(wú)水乙醇淋洗Sep-Pak C18柱進(jìn)行活化。將準(zhǔn)備好的188Re-NGR溶液加入Sep-Pak C18柱中,以10 mL的蒸餾水將未反應(yīng)完的188ReO4-洗去,用氮?dú)獯蹈晒枘z柱后,以1 mL的80%乙醇淋洗Sep-Pak,此部分為188Re-NGR。TLC法測(cè)定放化純度的條件與測(cè)標(biāo)記率的相同。

圖1 NGR的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 188 Re-NGR制備流程示意圖

2.3 188Re-NGR穩(wěn)定性測(cè)定

取200μL188Re-NGR,用 500μL的小牛血清稀釋,于 37 ℃下保存 ,分別于 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h取少量樣品測(cè)放化純度。

2.4 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布

將30只腫瘤直徑約 0.8～1.0 cm的荷Hep G2瘤裸鼠模型隨機(jī)分成 6組,每組 5只,經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL(7.4 MBq)188Re-NGR,于注射后1、2、4、8、12、24 h 按組將小鼠處死。另取5只荷HePG2瘤裸鼠作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制組,于注射188Re-NGR前1 h先注射未標(biāo)記的NGR(NGR與188Re-NGR摩爾比為10∶1),并于注射188Re-NGR后12 h處死。取血及主要臟器,稱(chēng)取臟器質(zhì)量并測(cè)量放射性計(jì)數(shù),經(jīng)衰減校正后計(jì)算每克組織的放射性攝取率(%ID/g)。并計(jì)算靶組織(T)與非靶組織(NT)的放射性攝取比(T/NT)。

2.5 SPECT顯像

取3只荷 HePG2瘤裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL(7.4 MBq)188Re-NGR,另取3只作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制組,注射188Re-NGR前1 h先注射未標(biāo)記的NGR(NGR與188Re-NGR摩爾比為10∶1),并于注射后 1、2、4、8 、12、24 h 進(jìn)行靜態(tài)顯像,使用針孔準(zhǔn)直器,矩陣 128×128,Zoom 1.33,每幀采集30 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 188Re-NGR的制備

該直接標(biāo)記法中以SnCl2快速還原188ReO4-,并采用葡萄糖酸鈉作為中間配體,與188Re保持弱絡(luò)合作用,將188Re保持在穩(wěn)定的低價(jià)態(tài),保證了188Re與還原后的NGR配位交換反應(yīng)的順利進(jìn)行。經(jīng)TLC法測(cè)定,標(biāo)記物中各成分的Rf列于表1。根據(jù)表1中各物質(zhì)的Rf計(jì)算可知,188Re-NGR的標(biāo)記率＞85%。

表1 標(biāo)記液中各成分在不同展開(kāi)體系中的R f

經(jīng)Sep-Pak C18反向萃取柱純化,188Re-NGR的放化純度＞90%。188Re-NGR比活度為(0.79±0.02)TBq/g。188Re-NGR 在 37 ℃小牛血清中放置 0 、0.5 、1、2、4、8、12、24 h 后 ,放化純度分別為 93.0%、91.8%、89.4%、88.9%、85.3%、82.0%、80.6%、65.7%,因此188Re-NGR可在體外穩(wěn)定存放2 h。

3.2 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布

188Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布列于表 2,由表2可知,188Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠血液中清除較快,注射后1 h放射性攝取為(2.53±0.21)%ID/g,注射后24 h為(0.19±0.02)%ID/g;注射后1～12 h腎臟攝取始終保持在約10%ID/g,標(biāo)記物在肝臟和腸道中亦有較高攝取,提示188Re-NGR主要經(jīng)腎臟排泄,其次為消化道;腫瘤組織 12 h攝取為(4.62±0.71)%ID/g,24 h時(shí)攝取仍有(2.01±0.38)%ID/g,表明188Re-NGR在腫瘤組織內(nèi)停留時(shí)間較長(zhǎng);骨骼肌等非靶組織攝取少且清除快。在競(jìng)爭(zhēng)性抑制組中,12 h時(shí)腫瘤組織放射性攝取為(1.43±0.61)%ID/g,明顯低于實(shí)驗(yàn)組。

表2 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布(,n=5)

表2 188 Re-NGR在荷HePG2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布(,n=5)

組織或器官放射性攝取/(%ID·g-1)1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 抑制組(12 h)血液 2.53±0.21 1.52±0.19 1.05±0.24 0.96±0.15 0.68±0.05 0.19±0.02 1.22±0.37心臟 1.73±0.13 2.68±0.51 1.62±0.14 1.53±0.18 1.21±0.26 0.52±0.14 1.37±0.40肺 1.21±0.31 1.39±0.23 1.14±0.27 1.07±0.09 0.83±0.20 0.28±0.06 0.97±0.52肝 7.15±0.53 9.12±0.81 8.21±0.33 6.51±0.60 6.28±0.45 4.75±0.42 5.16±1.04脾 1.82±0.22 2.11±0.30 1.57±0.15 1.12±0.31 0.94±0.11 0.51±0.23 1.20±0.29腎 9.51±0.62 10.84±0.42 14.05±0.68 14.73±0.84 11.92±0.39 4.03±0.34 15.82±0.70胃 1.02±0.24 1.62±0.16 1.04±0.41 0.84±0.12 0.53±0.08 0.31±0.07 0.91±0.53腸道 3.11±0.61 7.51±0.67 6.85±0.73 5.01±0.41 4.16±0.56 2.06±0.29 4.55±0.47肌肉 1.25±0.20 1.24±0.25 1.16±0.13 1.10±0.21 0.97±0.34 0.94±0.15 1.33±0.27腫瘤 2.84±0.51 3.12±0.72 3.55±0.21 3.98±0.37 4.62±0.71 2.01±0.38 1.43±0.61

表3 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠中的T/NT,n=5)

表3 188 Re-NGR在荷HepG2瘤裸鼠中的T/NT,n=5)

組織或器官T/NT 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h 抑制組(12 h)腫瘤與肌肉 2.27±0.31 2.52±0.20 3.06±0.49 3.62±0.55 4.76±0.36 2.14±0.11 1.08±0.24心臟與肌肉 1.38±0.21 2.16±0.35 1.40±0.16 1.39±0.41 1.25±0.22 0.56±0.19 1.03±0.11肺與肌肉 0.97±0.22 1.12±0.30 0.98±0.17 0.95±0.21 0.86±0.14 0.31±0.09 0.80±0.26肝與肌肉 5.72±1.03 7.35±0.94 7.08±1.08 5.92±0.61 6.47±0.42 5.10±0.27 3.89±0.80脾與肌肉 1.46±0.12 1.71±0.18 1.34±0.09 1.01±0.06 0.96±0.20 0.55±0.14 0.89±0.11腎與肌肉 7.61±0.70 8.73±0.68 12.10±0.43 13.41±0.37 12.28±0.62 4.32±0.20 11.90±0.58胃與肌肉 0.81±0.19 1.31±0.22 0.90±0.15 0.76±0.26 0.55±0.11 0.34±0.17 0.69±0.20腸與肌肉 2.48±0.31 6.05±0.58 5.90±0.42 4.55±0.39 4.28±0.41 2.19±0.25 3.42±0.52

2.3 荷HePG2瘤裸鼠的SPECT顯像

荷HePG2瘤裸鼠注射188Re-NGR后的SPECT顯像示于圖3。188Re-NGR在荷 HepG2瘤裸鼠中的 T/NT列于表 3。由表3可知,注射188Re-NGR后 1 h腫瘤即可顯影,其中,腎、胃及腸道等組織攝取量較高,隨時(shí)間延長(zhǎng),腹腔本底、血液及肌肉等組織攝取降低,腫瘤的攝取逐漸增多,T/NT也隨之增高。12 h腫瘤T/NT為4.76,其顯像最為清晰,24 h仍有顯影。圖3顯示,在4～8 h顯像清晰,競(jìng)爭(zhēng)性抑制組注射188Re-NGR后腫瘤未顯影。該結(jié)果表明,腫瘤對(duì)188Re-NGR的攝取是通過(guò)受體介導(dǎo)的特異性攝取。

圖3 荷Hep G2瘤裸鼠188 Re-NGR SPECT顯像

3 小 結(jié)

(1)本工作采用中間配體交換的方法進(jìn)行188Re-NGR的制備,該反應(yīng)時(shí)間短,易于完成,標(biāo)記率可達(dá)85%,放化純度＞90%,能夠滿(mǎn)足體內(nèi)外受體研究要求,標(biāo)記物在體外能穩(wěn)定存放2 h。

(2)188Re-NGR主要通過(guò)腎臟代謝,部分經(jīng)腸道代謝;在腫瘤組織中有明顯攝取,且存留時(shí)間較長(zhǎng);抑制組對(duì)188Re-NGR的攝取明顯低于實(shí)驗(yàn)組,且腫瘤部位不顯像。以上結(jié)果說(shuō)明,腫瘤對(duì)188Re-NGR的攝取是通過(guò)受體介導(dǎo)的特異性攝取。

(3)188Re-NGR注入荷瘤裸鼠體內(nèi)后4 h即可顯像。

188Re-NGR不僅可用于腫瘤顯像,亦能為進(jìn)行腫瘤治療的適應(yīng)征選擇及療效評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

由于188Re的半衰期較短,可防止高能β射線(xiàn)對(duì)骨髓等正常組織可能引起的損傷,并可采用多次給藥的方式以提高療效。NGR可與多種藥物耦聯(lián),可提高靶向性。因此,今后將著力進(jìn)行188Re標(biāo)記 NGR-IFN及NGR-VEGI等融合蛋白的腫瘤顯像及治療研究。

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