李洪玉,梁積新,羅洪義,陳寶軍,楊春慧,鄭德強

(中國原子能科學研究院同位素研究所,北京 102413)

前哨淋巴結(jié)(SLN)是接受原發(fā)腫瘤淋巴回流的第一個或笫一組淋巴結(jié),是最早可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的特異淋巴結(jié)。放射導向的前哨淋巴結(jié)活組織切片檢查(SLNB)是一種在早期乳腺癌和黑色素瘤處置方面被廣泛認可的技術(shù),尤其在腫瘤發(fā)病初期,用于檢測位于隱匿性區(qū)域的前哨淋巴結(jié)并對其是否發(fā)生癌轉(zhuǎn)移進行評估,對治療方案的選擇具有重要意義[1-6]。

目前用于SLNB的放射性顯像劑主要是納米型藥物,有99Tcm-硫化錸膠體、99Tcm-經(jīng)過濾的硫膠體和99Tcm-HSA[7]。這類顯像劑在前哨淋巴結(jié)的攝取是基于淋巴結(jié)對藥物微粒的生理俘獲,這是一個可飽和的過程,藥物顆粒的大小和給藥區(qū)域的表面性質(zhì)會影響藥物從注射點引流至毛細淋巴管的速率及淋巴結(jié)巨噬細胞吞噬藥物的速率。比如,分子顆粒較大時,藥物進入淋巴內(nèi)皮細胞的速率會相對慢些,而其在注射點和前哨淋巴結(jié)的滯留會相對多些;微粒直徑在20 nm以下的分子則不適于前哨淋巴結(jié)顯像,因為它們會很快被引流至下一級淋巴結(jié)。顆粒度為100 nm左右的膠體藥物顆粒較易進入到毛細淋巴管并被巨噬細胞吞噬而滯留在淋巴結(jié),而更大的顆粒則會被胞間隙俘獲。因此,該類藥物可能存在一些缺點,如:在注射點有高濃集、分子顆粒大小不均、易發(fā)生放射性從SLN到2LN的遷移等[8]。99Tcm-硫化錸膠體是一種粒徑范圍在20～400 nm,并在100 nm有較高分布的藥物。

本工作擬采用藥盒法制備99Tcm-硫化錸膠體,并將其稀釋后再注入小鼠體內(nèi),考察注射劑量及穩(wěn)定劑濃度對99Tcm-硫化錸膠體在小鼠淋巴結(jié)放射性攝取及體內(nèi)生物分布的影響,為開發(fā)新型淋巴結(jié)顯像藥物提供參考。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

99Mo-99Tcm發(fā)生器:原子高科股份有限公司產(chǎn)品;FH 463A自動定標器、FT-603型閃爍探頭:北京核儀器廠產(chǎn)品;CRC15R 放射性活度計:美國CAPINTEC公司產(chǎn)品;微量注射器:美國Hamilton公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

1.3 實驗動物

Balb/C 小白鼠:60只,雄性,18～22 g,清潔級,由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。

2 實驗方法

2.1 99 Tcm-硫化錸膠體室溫穩(wěn)定性

將標記溶液原液于室溫下靜置5 h,分別于1、2、3、4、5 h采用紙層析分析法分析其放化純度。

2.2 注射劑量對生物分布的影響

用生理鹽水注射液對99Tcm-硫化錸膠體溶液進行 10、100、500、715倍稀釋 。

將60只Balb/C小白鼠隨機分為5個劑量組,每劑量組12只,每劑量組又分為兩組(每組6只),分別于給藥后1、4 h處死。每組小鼠由后腳墊皮下注射5μL99Tcm-硫化錸膠體及不同稀釋倍數(shù)99Tcm-硫化錸膠體稀釋液,99Tcm-硫化錸膠體的注射劑量依次為0.343、3.43×10-2、3.43×10-3、6.86×10-4、4.80×10-4μg,按摩腳掌0.5 min;在給藥一側(cè)的腳墊處皮下注入專利藍溶液,再按摩腳掌0.5 min,以便解剖時獲取淋巴結(jié)位點。注入專利藍溶液10 min后處死小鼠,取腘窩淋巴結(jié)(SLN)、腰淋巴結(jié)(次級淋巴結(jié),2LN)、注射點(后足)、肝、脾、血 ,測量放射性計數(shù),計算放射性攝取率(%ID/g)及腘窩淋巴結(jié)提取率,計算公式如下:

腘窩淋巴結(jié)提取率體現(xiàn)了藥物在第一淋巴結(jié)滯留的比率,該值越大,說明藥物向下一級淋巴結(jié)遷移的可能性越小。

2.3 注射體積的影響

Balb/C小白鼠12只,隨機分為2組(每組6只),將上述進行715倍稀釋的溶液再稀釋4倍,之后由小鼠后腳墊皮下注射20μL,分別于注后1、4 h處死小鼠,其它步驟同2.2節(jié)。比較注射化學量為4.80×10-4μg時,注射體積為5μL和20μL對99Tcm-硫化錸膠體生物分布的影響。

2.4 明膠濃度的影響

用濃度為3 g/L的明膠溶液對標記原液進行100倍的稀釋,溶液中明膠濃度約0.03 g/L。取12只Balb/C小白鼠,隨機分為2組,每組6只,由小鼠后腳墊皮下注射5μL該稀釋液,分別于注射后1、4 h處死小鼠,其他步驟同2.2節(jié)?？疾熳⑸鋭┝繛?.43×10-3μg時,明膠濃度對99Tcm-硫化錸膠體生物分布的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 99 Tcm-硫化錸膠體室溫穩(wěn)定性

99Tcm-硫化錸膠體溶液室溫放置5 h,放化純度未見下降低,均在95%以上。

3.2 生物分布

99Tcm-硫化錸膠體的注射劑量對其在小鼠淋巴結(jié)及體內(nèi)分布的影響列于表1。腘窩淋巴結(jié)提取率隨注射劑量及時間的變化列于表2。

表1 注射劑量對小鼠體內(nèi)生物分布的影響(,n=6)

表1 注射劑量對小鼠體內(nèi)生物分布的影響(,n=6)

注射后時間 組織放射性攝取率/(%ID·g-1)反應原液 稀釋10倍 稀釋100倍 稀釋500倍 稀釋715倍SLN 5.59±0.84 2.86±0.77 2.77±0.99 2.11±0.11 1.76±0.70 2LN 4.07±0.75 1.04±0.39 0.71±0.55 0.29±0.10 0.54±0.22 1 h 注射點 49.12±3.11 46.25±3.84 64.45±2.88 67.86±2.34 66.02±3.19肝 11.78±1.73 2.29±0.57 1.57±0.37 0.98±0.10 1.15±0.27脾0.26±0.01 0.07±0.01 0.13±0.04 0.12±0.03 0.14±0.08血2.25±0.13 0.74±0.10 0.72±0.14 0.88±0.10 0.66±0.18 SLN 8.47±2.13 5.63±1.34 5.05±0.93 2.04±0.47 1.88±0.28 2LN 4.89±1.19 1.19±0.19 0.84±0.44 0.47±0.06 0.36±0.14 4 h 注射點 48.61±3.27 52.43±2.52 64.15±3.85 70.65±3.10 71.12±1.63肝9.65±1.44 2.54±0.30 1.66±0.79 0.97±0.11 0.95±0.18脾0.24±0.04 0.07±0.01 0.15±0.04 0.14±0.03 0.17±0.04血1.15±0.07 0.50±0.28 0.69±0.23 0.88±0.11 0.81±0.23

表2 注射劑量對腘窩淋巴結(jié)提取率的影響(,n=6)

表2 注射劑量對腘窩淋巴結(jié)提取率的影響(,n=6)

腘窩淋巴結(jié)提取率/%注射后時間反應原液 稀釋10倍 稀釋100倍 稀釋500倍 稀釋715倍1 h 27.2 63.6 74.4 86.3 69.3 4 h 42.3 78.9 83.4 77.0 80.9

由表1可知,注射99Tcm-硫化錸膠體原液后,近50%的99Tcm-硫化錸膠體滯留在注射點處,(由粒徑較大的藥物顆粒引起),但這并不影響未滯留的藥物進入淋巴引流至SLN,在SLN的攝取于注射后4 h約8.5%,此時淋巴結(jié)處于一種過飽和狀態(tài),因此不能滯留的藥物顆粒會經(jīng)淋巴管進入血液,并最終停留在肝和脾內(nèi),因此肝的攝取率較高。

注射稀釋后的標記溶液后,被注射的藥物顆粒數(shù)降低,則在前哨淋巴結(jié)的攝取未達到飽和狀態(tài),因此腘窩淋巴結(jié)的放射性會相應降低,且僅有少量膠體顆粒會進入血液,因此,肝和血液中的攝取也相應減少。

由表2可以看出,腘窩淋巴結(jié)提取率隨劑量減小而升高,且隨時間延長升高。

注射體積及明膠濃度對99Tcm-硫化錸膠體在淋巴結(jié)及小鼠體內(nèi)分布的影響列于表3。明膠是一種分散劑,在NANOCIS?藥盒中起著穩(wěn)定劑的作用,用于防止膠體顆粒相互聚集形成聚合體,而大顆粒的聚合體往往會滯留在注射點并造成注射點的高濃集,這也是稀釋后注射點的滯留反而會增大的原因。由表3可知,將溶液中明膠的濃度由0.03 g/L增加至3 g/L時,SLN的放射性攝取有大幅提高,但2LN的放射性攝取同時也有較大提高;肝攝取上升了近10倍;注射點的放射性攝取降低,給藥4 h后,降低更為明顯,由64.15%降至 41.77%。注后1 h,腘窩淋巴結(jié)提取率的降低顯著,由74.4%降至27.2%。

在同一個時相,注射體積由 5μL增加到20μL時,SLN的放射性攝取有所降低,在注射4 h后由1.88%ID·g-1降至1.08%ID·g-1;在注射點的濃集則有約5%的增加;腘窩淋巴結(jié)提取率在注后1 h基本不變,而在注后4 h,由80.9%降至52.8%。這是由于單位體積內(nèi)藥物顆粒數(shù)降低,在前哨淋巴結(jié)的攝取不能達到飽和狀態(tài),因此腘窩淋巴結(jié)的放射性會相應降低,且僅有少量膠體顆粒會進入血液,因此,肝和血液中的攝取也相應減少。

注射體積增大,過量的溶劑會對淋巴結(jié)產(chǎn)生占位飽和效應,使得其對藥物的攝取降低,另外,在動物腳掌這樣一個相對狹小的范圍里皮下注射,注射的體積過大,不利于藥物的吸收,且容易引起注射點發(fā)炎滲水的現(xiàn)象。因此,應在合理范圍內(nèi)盡可能減少注射體積。

表 3 注射體積及明膠濃度對體內(nèi)分布的影響(,n=6)

表 3 注射體積及明膠濃度對體內(nèi)分布的影響(,n=6)

注:1)為溶液中明膠的濃度為0.03 g/L;2)為溶液中明膠的濃度為3 g/L

放射性攝取率/(%ID·g-1)注射后時間 組織5μL 20μL 5μL1) 5μL 2)SLN 1.76±0.70 1.71±0.51 2.77±0.99 3.38±0.86 2LN 0.54±0.22 0.53±0.18 0.71±0.55 2.46±0.47 1 h 注射點 66.02±3.19 70.70±3.46 64.45±2.88 56.39±2.81肝1.15±0.27 1.45±0.32 1.57±0.37 10.19±1.12脾0.14±0.08 0.19±0.02 0.13±0.04 0.28±0.08血0.66±0.18 0.91±0.17 0.72±0.14 1.60±0.30 SLN 1.88±0.28 1.08±0.38 5.05±0.93 9.69±1.98 2LN 0.36±0.14 0.51±0.21 0.84±0.44 3.80±1.93 4 h 注射點 71.12±1.63 77.41±1.76 64.15±3.85 41.77±5.45肝0.95±0.18 1.32±0.32 1.66±0.79 12.44±4.44脾0.17±0.04 0.19±0.04 0.15±0.04 0.40±0.12血0.81±0.23 1.40±0.71 0.69±0.23 0.65±0.09

5 小 結(jié)

注射體積增大,會造成淋巴結(jié)對藥物的攝取降低;注射劑量減少,雖然在淋巴結(jié)的攝取減少,但腘窩淋巴結(jié)提取率卻有較大提升,并且在肝和血液中的攝取也會降低;稀釋后保持穩(wěn)定劑明膠的濃度與原液中的濃度相當時,SLN的放射性攝取有大幅提高,但腘窩淋巴結(jié)提取率卻顯著降低,而且肝攝取也有大幅提高。

注射劑量是影響該類藥物在小鼠淋巴結(jié)體內(nèi)生物分布的關(guān)鍵因素,注射劑量和注射體積之間也存在一定的交互作用,因此,應在可行的前提下盡量降低注射體積,同時在進行注射劑量的選擇時,應綜合考慮注射劑量及明膠濃度對SLN、2LN及注射點的攝取所產(chǎn)生的效應。

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