康 磊,王榮福,閆 平,張春麗,劉 萌,徐小潔

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,北京 100034;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100850)

惡性腫瘤作為目前嚴(yán)重危害人類生命健康和生存質(zhì)量的疾病,一直被科學(xué)家廣泛關(guān)注。端粒酶是惡性腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一種生物標(biāo)記物,其核心成分端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(Human Telomerase Reverse Trancriptase,hTERT)是端粒酶的限速亞單位,是細(xì)胞癌變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。隨著 RNA干擾技術(shù)的深入研究,針對(duì)hTERT基因的有效RNA干擾序列已被篩選出來,為構(gòu)建h TERT靶向的RNA探針奠定了基礎(chǔ)。已有研究[2]證實(shí)hTERT靶向的反義寡核苷酸探針具備端粒酶體內(nèi)顯像的功能。類似于反義顯像技術(shù),可將放射性核素標(biāo)記的人工合成小干擾RNA(Small Interfevene RNA,siRNA)技術(shù)引入體內(nèi),siRNA的反義鏈與靶基因通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相結(jié)合,使用體外顯像設(shè)備對(duì)其體內(nèi)的分布情況進(jìn)行示蹤。而且,利用放射性核素對(duì)siRNA進(jìn)行標(biāo)記,不僅可以起到對(duì)標(biāo)記探針的示蹤作用,還能夠利用siRNA與基因的特異性靶向結(jié)合的特性對(duì)靶向基因進(jìn)行顯像研究。

本課題組之前使用NHS-MAG3這一雙功能螯合劑對(duì)siRNA進(jìn)行99Tcm標(biāo)記,獲得了較理想的標(biāo)記結(jié)果和體外穩(wěn)定性[3]。在此基礎(chǔ)上,本研究擬選擇h TERT這一腫瘤特征性基因作為靶點(diǎn),制備99Tcm標(biāo)記的siRNA探針,通過評(píng)價(jià)其對(duì)hTERT高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的體外干擾活性及體內(nèi)生物分布,探討siRNA標(biāo)記探針在端粒酶內(nèi)示蹤的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

電子天平(FA1104):上海精科天平公司產(chǎn)品;恒壓恒流器、蛋白電泳儀、濕性電轉(zhuǎn)移儀:北京六一儀器廠產(chǎn)品;AXIMA-CFRplus電離飛行質(zhì)譜儀:英國Kratos Analytical公司產(chǎn)品;凝膠成像分析系統(tǒng)(AlphaImager-2200):美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品;二氧化碳培養(yǎng)箱:美國Thermo Electron公司產(chǎn)品;暗盒:北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品;液氮罐、CO2罐:東亞公司產(chǎn)品;超凈臺(tái):美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品。RM905放射性活度儀:中國計(jì)量科學(xué)研究院提供;FT-163放射免疫測(cè)量儀:國營262廠產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)組siRNA的靶點(diǎn)為h TERT mRNA的第 3 119～3 137位核苷酸(19 bp),即 5′-TTTCATCAGCAAGTTTGGA-3′[4]。 對(duì) 照 組siRNA以人類無關(guān)基因序列為靶點(diǎn),即 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′:由上海吉瑪公司化學(xué)合成,2′-OMe修飾,3′端連接 d(TT)基團(tuán),5′端連接6碳己基及伯胺結(jié)構(gòu)。S-乙?；?NHS-MAG3:純度 ＞99.9%,Hnatowich教授(University of Massachusetts Medical School)惠贈(zèng)。

兔抗人 TERT、β-tubulin多克隆抗體:Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體:北京中杉金橋生物技術(shù)公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000、胎牛血清、高糖DMEM:美國Invitrogen公司。新華一號(hào)試紙、常用分析純化學(xué)試劑:北京化學(xué)試劑公司。99Mo-99Tcm發(fā)生器:原子高科股份有限公司產(chǎn)品。Sephadex G25:美國GE Amersham公司產(chǎn)品。Hep G2肝癌細(xì)胞:美國ATCC中心提供。

1.3 動(dòng)物模型

50只雌性BALB/c nu/nu裸鼠,體重(20±4)g,4～6周齡,SPF級(jí)別飼養(yǎng):北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)腋下,SPF條件下飼養(yǎng)20 d,腫瘤體積長至約1 cm3進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)記探針的制備

將反義鏈RNA與NHS-MAG3(N-hydroxysuccinimidyl Derivative of S-Acetyl Mercaptoacetyltriglycine,NHS-MAG3)混合振蕩1～2 h,與正義鏈按摩爾比1∶1退火雜交成MAG3耦聯(lián)的siRNA雙鏈。在此siRNA雙鏈中加入新鮮的SnCl2·2H 2O及新鮮淋洗的99TcmO4-液進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)路線示于圖1。采用Sephadex G25對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行純化。紙層析法分析其標(biāo)記率和放化純度:新華一號(hào)試紙為固定相,丙酮和生理鹽水分別為展開劑。采用質(zhì)譜法鑒定MAG3-RNA的結(jié)構(gòu)。

圖1 99Tcm標(biāo)記的siRNA反應(yīng)路線

2.2 體外hTERT蛋白抑制實(shí)驗(yàn)

使用Lipofectamine 2000分別將染脂質(zhì)體、未標(biāo)記和99Tcm標(biāo)記的 siRNA轉(zhuǎn)染至 HepG2細(xì)胞,72 h后收集細(xì)胞。未轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞作對(duì)照。常規(guī)蛋白印跡(Western Blotting,WB)法鑒定hTERT和β-tubulin的蛋白含量。將聚丙烯酰胺(SDS)加入收集細(xì)胞中煮沸15 min,離心后取上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺差示(SDS-PAGE)凝膠電泳。繼而電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,使用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜。此后用5%脫脂奶粉稀釋的抗hTERT和β-tubulin抗體室溫孵育1 h,洗膜3次,再孵育以體積比 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的羊抗兔IgG,洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min,壓片顯影。

2.3 荷瘤鼠體內(nèi)的生物分布

50只荷HepG2瘤裸鼠隨機(jī)均分為兩組,每組分別注射99Tcm標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組探針和對(duì)照組探針。每只裸鼠尾靜脈注射 200μL(1.85 MBq)99Tcm-siRNA。分別于注射后0.5、1、2、4、6 h摘眼采血100μL。脫頸處死后,取心臟 、肝臟 、脾臟 、肺臟 、腎臟 、胃 、小腸 、膀胱 、骨骼肌、小腿長骨、腫瘤,稱重并測(cè)定其放射性計(jì)數(shù),計(jì)算各組織的百分注射劑量率(%ID/g)及腫瘤與非腫瘤放射性攝取比(T/NT)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各變量均使用ˉx±s表示。方差分析ANOVA法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。P值小于0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 99Tcm-siRNA的制備

NHS-MAG3的耦聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜鑒定,鑒定結(jié)果示于圖2。耦聯(lián)前RNA的相對(duì)分子質(zhì)量為7 061.4,耦聯(lián)后MAG3-RNA的相對(duì)分子質(zhì)量為7 307.1,螯合前后的相對(duì)分子質(zhì)量之差與理論值相符,證實(shí)RNA分子與NHS-MAG3的耦聯(lián)成功。

NHS-MAG3耦聯(lián)的 siRNA雙鏈與99Tcm在室溫下反應(yīng)1 h可得99Tcm標(biāo)記的 siRNA。反應(yīng)產(chǎn)物中含有三種物質(zhì):游離锝(未被亞錫離子還原的99TcmO4-)、水解锝(99TcmO2·n H2O)和99Tcm-siRNA。使用丙酮作展開劑時(shí),游離锝的 Rf為0.9～1.0,水解锝和絡(luò)合锝的Rf為0～0.1;使用生理鹽水作展開劑時(shí),水解锝的R f為0～0.1,游離锝和絡(luò)合锝的 R f為 0.8～1.0。經(jīng)計(jì)算得到:99Tcm-siRNA的標(biāo)記率大于73%,放化純度大于92%,比活度達(dá)1.85 TBq/g。

圖2 RNA相對(duì)分子質(zhì)量質(zhì)譜分析a——耦聯(lián)前;b——耦聯(lián)后

3.2 hTERT蛋白抑制實(shí)驗(yàn)

蛋白印跡法比較未轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)染未標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組siRNA腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組99Tcm-siRNA腫瘤細(xì)胞的hTERT蛋白表達(dá)水平。h TERT蛋白抑制實(shí)驗(yàn)示于圖3。由圖3結(jié)果計(jì)算可知,hTERT靶向的實(shí)驗(yàn)組siRNA對(duì)hTERT蛋白表達(dá)具有顯著的抑制效果,以β-tubulin管家蛋白為參照,轉(zhuǎn)染未標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組siRNA的腫瘤細(xì)胞中蛋白抑制率為(76.32±3.43)%,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組99Tcm-siRNA的腫瘤細(xì)胞中蛋白抑制率為(76.78±2.95)%,二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。與未轉(zhuǎn)染和僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的腫瘤細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組99Tcm-siRNA的細(xì)胞其蛋白表達(dá)量的平均抑制率為76.7%。

蛋白抑制結(jié)果顯示,siRNA探針在耦聯(lián)NHS-MAG3和標(biāo)記99Tcm后的干擾活性無明顯改變,說明 siRNA反義鏈5'端連接的六碳己基、氨基、MAG3基團(tuán)的耦聯(lián)及99Tcm的標(biāo)記未影響siRNA分子的干擾活性以及靶向結(jié)合能力。這可能由于采用2'-OMe修飾siRNA能夠提高其核酸酶抵抗力,并降低激發(fā)免疫反應(yīng)、脫靶效應(yīng)的可能性[5],NHS-MAG3基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡單,對(duì)標(biāo)記分子的空間構(gòu)型、結(jié)合區(qū)域、活性位點(diǎn)的影響小,保證了探針的生物活性[6]。

3.3 生物分布

99Tcm標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組siRNA和對(duì)照組siRNA在各組織的放射性分布結(jié)果分別列于表1和表2。對(duì)比表1和表2可知,兩種探針在腎臟的放射性攝取在各時(shí)間點(diǎn)均為最高,其次為肝臟。血液的放射性分布在注射后初始較高,但是隨著時(shí)間延長而迅速下降,在6 h時(shí)最低。血供豐富的臟器(例如心臟、肺臟、脾臟和骨髓)其放射性分布情況與血液類似,均隨時(shí)間延長而持續(xù)降低。胃腸系統(tǒng)包括胃和小腸的放射性分布均不高。

圖3 各組細(xì)胞的hTERT蛋白表達(dá)a——各組細(xì)胞的h TERT和β-tubulin蛋白表達(dá)結(jié)果;b——hTERT與β-tubulin蛋白的條帶亮度比

表1 99 Tcm標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組siRNA在荷Hep G2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布(,n=5)

組織或器官放射性攝取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h心臟 0.76±0.10 0.43±0.05 0.41±0.14 0.38±0.10 0.32±0.06肝臟 7.68±0.84 3.08±0.32 1.63±0.38 1.56±0.12 0.99±0.05脾臟 0.78±0.15 0.50±0.11 0.41±0.07 0.36±0.05 0.25±0.08肺臟 1.36±0.09 1.03±0.23 0.98±0.10 0.96±0.08 0.65±0.15腎臟 9.31±2.68 5.80±2.80 4.47±0.85 2.72±0.63 1.99±0.59胃 3.06±0.84 1.66±0.10 1.44±0.40 1.24±0.27 1.20±0.35小腸 4.20±1.93 2.77±0.76 2.10±1.24 0.95±0.41 0.64±0.07膀胱 2.60±0.78 2.08±0.33 2.39±0.41 3.42±2.30 3.56±0.49骨骼肌 0.61±0.15 0.31±0.04 0.58±0.49 0.22±0.05 0.17±0.01長骨 1.06±0.21 0.59±0.06 0.39±0.19 0.19±0.05 0.10±0.03血液 0.88±0.14 0.52±0.03 0.44±0.06 0.43±0.08 0.40±0.06腫瘤 1.08±0.07 0.82±0.16 0.71±0.14 0.74±0.15 0.97±0.15

表2 99 Tcm標(biāo)記的對(duì)照組siRNA在荷Hep G2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布(,n=5)

表2 99 Tcm標(biāo)記的對(duì)照組siRNA在荷Hep G2瘤裸鼠體內(nèi)生物分布(,n=5)

組織或器官放射性攝取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h心臟 0.68±0.37 0.34±0.09 0.27±0.07 0.16±0.02 0.18±0.05肝臟 4.22±0.94 2.20±0.92 1.27±0.32 0.88±0.12 0.49±0.15脾臟 1.68±0.66 0.51±0.23 0.38±0.12 0.27±0.04 0.13±0.08肺臟 1.13±0.44 0.76±0.10 0.48±0.13 0.23±0.08 0.22±0.04腎臟 10.17±3.86 8.20±1.61 5.74±1.90 2.14±0.86 1.85±0.58胃 0.87±0.35 2.21±0.72 1.41±0.50 0.86±0.24 0.52±0.21小腸 1.66±0.72 0.80±0.05 0.41±0.13 0.25±0.04 0.23±0.02膀胱 2.83±0.78 1.77±0.76 0.32±0.09 0.22±0.11 0.28±0.17骨骼肌 1.18±0.36 0.31±0.07 0.21±0.08 0.11±0.04 0.08±0.02長骨 1.01±0.71 0.35±0.03 0.24±0.04 0.19±0.00 0.14±0.05血液 2.55±0.81 0.93±0.36 0.56±0.17 0.33±0.02 0.33±0.14腫瘤 1.88±0.05 0.66±0.19 0.43±0.09 0.27±0.04 0.16±0.06

由表1可見,注射99Tcm標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組siRNA探針后,腫瘤的放射性分布在0.5 h時(shí)低于血液和其他臟器。但在1 h后,腫瘤的放射性分布隨時(shí)間延長而逐漸增加,由(0.82±0.16)%ID/g增加至(0.97±0.15)%ID/g。相比之下,血供豐富的臟器其放射性分布均隨時(shí)間延長不斷降低,特別是血液的分布降低較快。可見,實(shí)驗(yàn)組 siRNA在腫瘤部位的滯留保持穩(wěn)定的水平。注射后0.5 h左右,放射性探針的生物分布主要反映的是在血池相的分布,屬于非特異性,因而血液及供血豐富的臟器其放射性分布較高。隨著時(shí)間延長,血液中的標(biāo)記探針逐漸與腫瘤靶點(diǎn)結(jié)合,導(dǎo)致探針在腫瘤的分布逐漸增加,而在其他臟器逐漸降低。

由表2可見,注射99Tcm標(biāo)記的對(duì)照組siRNA后,腫瘤的放射性分布隨時(shí)間延長而不斷降低,0.5 h時(shí)為(1.88±0.05)%ID/g,到6 h時(shí)僅為(0.16±0.06)%ID/g。其他臟器的放射性分布也呈現(xiàn)下降趨勢(shì),可見對(duì)照siRNA在腫瘤中的分布和其他臟器的分布相近,無明顯特異性。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組可知,兩探針在腫瘤部位的放射性分布存在顯著性差異(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組在腫瘤部位的分布不斷增加,而對(duì)照組不斷降低。以上結(jié)果提示,h TERT靶向的siRNA在腫瘤靶向濃聚的特異性。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組T/NT分別列于表3和表4。表3和表 4顯示,除肝臟、肺臟、小腸骨骼肌外,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組探針在其他組織的T/NT 6 h內(nèi)均有顯著性差異(p＜0.05)。在注射實(shí)驗(yàn)組探針后第6 h時(shí),所有臟器的T/NT均顯著高于對(duì)照組(p＜0.05),其腫瘤與血液和腫瘤與骨骼肌的T/NT分別為2.62±0.70和6.02±0.52,相比之下,對(duì)照組的腫瘤與血液的T/NT在注射后各時(shí)間點(diǎn)均未超過1.00。

表3 99 Tcm標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組siRNA注射后6 h內(nèi)的T/NT(ˉx±s,n=5)

表4 99Tcm標(biāo)記的對(duì)照組siRNA注射后 6 h內(nèi)的T/NT(ˉx±s,n=5)

以上結(jié)果提示,99Tcm標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)組siRNA探針在體內(nèi)十分穩(wěn)定,且在腫瘤部位顯示出濃聚效果,其清除速率比血液清除慢,使得腫瘤的靶本底增加,說明siRNA探針具有在體內(nèi)特異性靶向結(jié)合的能力。

作為小分子水溶性探針,siRNA在腎臟、尿液的分布較高,可能是由于腎臟近曲小管對(duì)核酸分子強(qiáng)烈的重吸收作用而導(dǎo)致[7]。腎臟的清除速度較肝臟快,迅速降低本底以提高探針的靶與本底的放射性之比,有利于靶向示蹤,特別是靶向顯像,但這同時(shí)限制了核酸探針在泌尿系統(tǒng)或肝臟腫瘤的示蹤應(yīng)用。隨著顯像時(shí)間延長,肝、腎的放射性分布逐漸減低,而腫瘤的放射性相對(duì)穩(wěn)定,從而提高了腫瘤與非腫瘤部位的放射性攝取比。因此,雙時(shí)相或者延遲采集法可以提高靶與本底的放射性之比[8]。

4 結(jié) 論

本研究通過體外基因干擾活性和體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn),證明99Tcm標(biāo)記的siRNA探針在體外和體內(nèi)均具備與靶向基因結(jié)合的特性。99Tcm標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組siRNA探針不僅能夠與活體h TERT表達(dá)陽性的腫瘤特異性地結(jié)合,而且可以對(duì)siRNA探針的體內(nèi)分布進(jìn)行實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)的示蹤。因此,99Tcm標(biāo)記的siRNA探針對(duì)活體腫瘤示蹤具有良好的研究前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

致謝:感謝 Hnatowich教授贈(zèng)與NHS-MAG3。

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