許 放，師詠梅，柳占彪，鐘文婕

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

痹祺膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎大 鼠 NO、HYP 的 影 響*

許 放，師詠梅，柳占彪，鐘文婕

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

[目的]觀察痹祺膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎（OA）一氧化氮（NO）、羥脯氨酸（HYP）的影響。[方法]選Wistar大鼠，木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)注射造模，痹祺膠囊灌胃治療8周，測(cè)定血清NO、HYP和尿HYP的含量。[結(jié)果]模型組造模后第1天尿HYP明顯升高[（17.07±4.10）mg/L]，第15天[（9.92±3.09）mg/L]和第64天[（13.77±1.32）mg/L]與正常組無(wú)明顯差異。模型組大鼠血清NO含量明顯升高（22.64μmol/L）；痹祺膠囊高、中治療組能明顯降低大鼠血清NO含量（18.24μmol/L和19.14μmol/L）。[結(jié)論]痹祺膠囊具有降低OA大鼠血清NO的含量，減輕由NO介導(dǎo)的對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷作用。

骨關(guān)節(jié)炎；痹祺膠囊；一氧化氮；羥脯氨酸

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是以關(guān)節(jié)軟骨損傷為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)生發(fā)展與一氧化氮（NO）的調(diào)控有關(guān)。軟骨基質(zhì)主要由膠原和蛋白多糖組成，當(dāng)發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，膠原的最終代謝產(chǎn)物羥脯氨酸（HYP）和炎癥細(xì)胞因子一氧化氮水平發(fā)生明顯變化。痹祺膠囊由黨參、丹參、白術(shù)、茯苓、馬錢子等組成，具有益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效，是治療骨關(guān)節(jié)炎的有效方劑。前期研究結(jié)果表明[1]，痹祺膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的壞死具有一定的保護(hù)作用，但作用機(jī)制不清。為了探討痹祺膠囊保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用機(jī)制，在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)觀察了OA大鼠尿中羥脯氨酸的變化及痹祺膠囊對(duì)OA大鼠血清一氧化氮含量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 50只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（180±10）g，購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。許可證號(hào)：SCX K（津）2009-0001。生產(chǎn)批號(hào)：20100425。

1.2 藥物 痹祺膠囊：天津京萬(wàn)紅藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：301510）。木瓜蛋白酶（Papain）：博士德公司進(jìn)口分裝（sigma）（批號(hào)：118K1465）。

1.3 試劑 水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠（批號(hào)：20081206）。一氧化氮試劑盒：南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20100513）。羥脯氨酸（HYP）試劑盒：南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20100513）。

1.4 儀器 FlexStation 3多功能微孔分析儀，CisBio公司生產(chǎn)。LDZ5-2離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司生產(chǎn)。HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市岸頭實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 參照文獻(xiàn)[2]方法造模。選雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（180±10）g，按 3mL/kg腹腔注射 10%的水合氯醛，麻醉后，大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)注射4%木瓜蛋白酶。

2.2 分組及給藥 選成功模型大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、痹祺膠囊1.296、0.648、0.324 g/kg劑量組，每組10只。另取10只，作為正常組。痹祺膠囊治療組分別按不同的劑量灌胃給藥，連續(xù)治療8周，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。

2.3 取材 在造模成功后的第1周和2周，分別采集大鼠12 h尿液，3 000 r/min，離心10min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定尿HYP含量。治療8周后，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10min，取血清4℃保存；測(cè)定血清NO和HYP的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.5軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 痹祺膠囊對(duì)OA大鼠尿HYP的影響 見(jiàn)表1。

表1 痹祺膠囊對(duì)OA大鼠尿HYP的影響（±s）Tab.1 Effectof Biqicapsuleon the HYPof urine in rats with osteoarthritis（±s）mg/L

表1 痹祺膠囊對(duì)OA大鼠尿HYP的影響（±s）Tab.1 Effectof Biqicapsuleon the HYPof urine in rats with osteoarthritis（±s）mg/L

注：與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 造模（第1天）造模（第64天）正常組 10 10.51±1.50 10.96±1.72 15.10±4.00模型組 10 17.07±4.10* 9.92±3.09 13.77±1.32痹祺 1.296 g/kg 10 17.64±4.02** 9.21±1.15 14.25±0.98痹祺 0.648 g/kg 10 17.16±4.66* 9.88±1.59 14.84±1.14痹祺 0.324 g/kg 10 18.27±7.82** 11.19±3.18 15.40±1.54造模（第15天）

由表1結(jié)果可知：模型組和痹祺膠囊各治療組大鼠尿羥脯氨酸含量在造模后第1周內(nèi)均明顯升高（P<0.01），從第2周起至第9周恢復(fù)到正常水平，與正常對(duì)照組均無(wú)明顯差異（P>0.05）。

3.2 痹祺膠囊對(duì)OA大鼠血清Hyp、NO的影響見(jiàn)表2。

表2痹祺膠囊對(duì)OA大鼠HYP、NO的影響（±s）Tab.2 Effectof Biqicapsule on serum HYP and NO in ratswith osteoarthritis（±s）

表2痹祺膠囊對(duì)OA大鼠HYP、NO的影響（±s）Tab.2 Effectof Biqicapsule on serum HYP and NO in ratswith osteoarthritis（±s）

注：與正常組比較：*P＜0.01；與模型組比較：▲P＜0.01。

組別 n 血清HYP(mg/L) 血清NO(μmol/L)正常組 10 15.10±3.99 17.17±2.21●●模型組 10 13.77±1.32 22.64±3.80*痹祺 1.296 g/kg 10 14.25±0.98 18.24±1.89▲痹祺 0.648 g/kg 10 14.84±1.14 19.14±1.94▲痹祺 0.324 g/kg 10 15.40±1.53 22.64±1.67*

由表2結(jié)果可知：各組血清羥脯氨酸無(wú)明顯變化（P>0.05）。模型組大鼠血清NO含量明顯高于正常組大鼠（P<0.01），痹祺膠囊 1.296、0.648 g/kg劑量組血清NO含量明顯降低，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明，痹祺膠囊能降低模鼠血清NO含量，減輕由NO介導(dǎo)的對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷作用。

4 討論

木瓜蛋白酶是一種含疏莖（－SH）肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，對(duì)動(dòng)蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，應(yīng)用木瓜蛋白酶復(fù)制骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型已是公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)方法[3]。關(guān)節(jié)軟骨由蛋白多糖和膠原組成，在生理情況下，蛋白多糖和膠原的分解代謝與合成代謝維持平衡，將木瓜蛋白酶注入關(guān)節(jié)后，可分解軟骨基質(zhì)的膠原蛋白，破壞軟骨基質(zhì)，使尿中膠原的最終分解產(chǎn)物羥脯氨酸排出增多。另外，由于雌激素與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)[4]，為排除雌激素對(duì)模型的影響，本實(shí)驗(yàn)選用了雄性大鼠。

Grabowski等[5]研究證實(shí)人類關(guān)節(jié)中的軟骨母細(xì)胞在體外培養(yǎng)中并無(wú)NO產(chǎn)生，只要加入炎性細(xì)胞因子，如白介素-1α（IL-1α）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-β（TNF-β）等，就會(huì)激活軟骨母細(xì)胞中的一氧化氮合酶（iNOS）而產(chǎn)生大量NO。OA時(shí)，滑膜中豐富的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等在炎性細(xì)胞因子的刺激下都可產(chǎn)生大量的NO[6]。邵欣欣等[7]研究結(jié)果證實(shí)：炎性細(xì)胞因子可誘導(dǎo)出高水平的NO，NO可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞增殖，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的合成，通過(guò)激活金屬蛋白酶和環(huán)氧合酶，促進(jìn)膠原降解，造成對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞。經(jīng)研究痹祺膠囊對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的壞死具有一定的保護(hù)作用[8]。中醫(yī)認(rèn)為本病發(fā)生的關(guān)鍵在于肝腎虧虛、正氣虛弱，痹祺膠囊可能是通過(guò)它的益氣養(yǎng)血功能，減輕OA的炎癥反應(yīng)，使炎性細(xì)胞因子的分泌減少，從而減少了由其刺激產(chǎn)生的NO，減輕了由NO介導(dǎo)的對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷作用。

[1]柳占彪，師詠梅，許 放，等.痹祺膠囊對(duì)大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織影響的病理形態(tài)觀察[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（4）：318－319.

[2]Murat N,Karadam B,Ozkal S,et al.Quantification of papain-induced ratosteoarthritis in relation to timewith the Mankin score[J].ActaOrthop Traumatol Turc,2007,41(3):233-237.

[3]吳 雷，黃朝梁.骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯窟M(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（12）:1742-1743.

[4]Gokhale JA,FrenkelSR,DicesarePE,etal.Estrogenandosteoarthritis[J].Am JOrthop,2004,33(2):71-80.

[5]Grabowski PS,Macpherson H,Ralston SH,et al.Nitric oxide production in cells derived from the human joint[J].Br JRheumatol,1996,35(3):207-212.

[6]Rediske JJ；Hoehne C F；Zhang B,et al.The inducible production of nitric oxide by articular cell types[J].Osteoarthritis Cartilage,1994,2(3):199-206.

[7]邵欣欣，田得祥，于長(zhǎng)隆，等.一氧化氮抑制兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的合成[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2001，20（1）：31－34.

[8]柳占彪，師詠梅，許 放，等.痹祺膠囊對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織影響的病理形態(tài)觀察[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（4）：318-321.

Effectsof Biqicapsuleon NO and HYP levels in ratswith Osteoarthritis

XUFang,SHIYong-mei,LIUZhan-biao,etal
（Research Instituteof TCM,Tianjin Universityof TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]Toobserve the effectofBiqicapsuleon the Nitric oxide(NO)and hydroxyproline(HYP)in ratswith osteoarthritis.[Methods]Wistar rats were used.Papain was injected into their knee joints to establish the animalmodel of osteoarthritis.They were treated with Biqicapsule through intragastric administration for 8 weeks.The contents of NO and HYP in serum and HYP in urinewere detected.[Results]The contentsofHYP in urinewereobviously increased inmodelgroup in the firstday[(17.07±4.10)mg/L,P<0.05],andwerenormalin the fifteenth day and sixty-fourth day[(9.92±3.09)mg/L,(13.77±1.32)mg/L,P>0.05].The contentsofNO in serum were obviously increased(22.64μmol/L,P<0.01)inmodelgroup.In treatmentgroup the contentsofNO in serum were decreased by Biqicapsule,1.296 g/kgand 0.648 g/kg(18.24μmol/Land 19.14μmol/L,P<0.01).[Conclusion]BiqiCapsule can decreaseserum contentsofNO in OA rats,and ameliorate the NO-mediated damage of the cartilage in joint.

osteoarthritis;Biqicapsule;NO;HYP

R289.5

A

1672-1519(2011)03-0237-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2007BAI47B04）。

師詠梅（1981-），女，在讀碩士，主要從事中藥藥理研究。

柳占彪。

2011-03-02）