陳積賢，張 潔，任振華，薛迪新，吳偉力，張仁虎，余 銘，林道浙，林 肖，黃建武，梁美珍，賀先偉，徐 平

p27蛋白是Polyak等于1994年在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β(TGF－β)處理的生長(zhǎng)抑制細(xì)胞及接觸生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子質(zhì)量為27 kd的耐熱細(xì)胞周期抑制蛋白，是p27基因的產(chǎn)物，屬kip類(lèi)，與p21、p57功能相似。新近發(fā)現(xiàn)它屬于細(xì)胞周期素 (cyclin)－周期素依賴(lài)性蛋白激酶 (CDK)抑制蛋白，能與cyclin－CDK復(fù)合物結(jié)合，控制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的“位點(diǎn)”，從而抑制細(xì)胞增殖［1］。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為p27基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，認(rèn)為其抑癌作用可能是其產(chǎn)物p27蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平以化學(xué)劑量方式與cyclin－CDK復(fù)合物，尤其是cyclin－CDK2復(fù)合物結(jié)合，阻止細(xì)胞增殖通過(guò)限制點(diǎn)—— “位點(diǎn)”的最關(guān)鍵因素，從而使細(xì)胞周期停止在G1期。但是在研究中很少發(fā)現(xiàn)有p27基因的缺失及突變。如果p27蛋白水平低下或缺失，可以導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，引起腫瘤發(fā)生。而表觀(guān)遺傳修飾方式之一的甲基化事件與基因的表達(dá)有密切聯(lián)系。所以本實(shí)驗(yàn)利用MSP甲基化檢測(cè)血液標(biāo)本中p27的啟動(dòng)子甲基化水平改變，并探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院腫瘤外科2007年2月—2009年12月手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者106例為研究對(duì)象。其中男63例，女43例;年齡＜60歲48例，≥60歲58例;Dukes分期:A+B期55例，C+D期51例;腫瘤部位:右半結(jié)腸16例，左半結(jié)腸32例，直腸58例;腫瘤大小:＜5 cm 67例，≥5 cm 39例;浸潤(rùn)深度:未達(dá)漿膜層29例，達(dá)漿膜層77例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例;分化程度:低分化25例，高中分化81例。選取同期健康體檢的正常者29例為對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 基因甲基化狀態(tài)分析:采用德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp Blood Mini KIT試劑盒提取血清。每份標(biāo)本使用2.5 ml血清，按照說(shuō)明書(shū)提取DNA并定量，按文獻(xiàn)方法略作修改進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鹽處理，針對(duì)修飾過(guò)的p27啟動(dòng)子CpG島序列，分別設(shè)計(jì)甲基化、非甲基化特異引物擴(kuò)增目的片段。引物序列為27M:5'－AAGA GGCGAGTTAGCGT－3;5'－AAAACGCCGCCGAACGA －3;27U:5'－ATGGAAGAGGTGAGTTAGT－3';5'－AAAACCCCAATTAAAAACA－3';反應(yīng)條件:94℃，10 min預(yù)變性后接由95℃，45 s;66℃，45 s;72℃，45 s三步組成的35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度p27M:195 bp(堿基對(duì))、p27U:212 bp。甲基化特異性的PCR反應(yīng)體系為25μl，包括2μl的修飾DNA，1×PCR bufferII(Perkin－Elmer)，2 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L dNTP，上下游引物各1μmol/L，和1 U AmpliTaq Gold polymerase(Perkin－Elmer)，反應(yīng)條件:首先95℃變性10 min，然后95℃變性30 s，特定溫度退火45 s，延長(zhǎng)72℃，45 s，共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照 (試劑盒提供)，不含DNA的蒸餾水作為陰性對(duì)照。10μl的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，運(yùn)用圖像采集與分析統(tǒng)，記錄并分析電泳結(jié)果，所有試驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均在SPSS 11.5軟件上處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p27基因甲基化狀態(tài) 以門(mén)靜脈血為實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)p27基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化情況。甲基化特異性引物擴(kuò)增的條帶則標(biāo)本計(jì)為甲基化 (M)，未甲基化特異性引物擴(kuò)增條帶則標(biāo)本計(jì)為未甲基化 (U)，電泳結(jié)果顯示在特異引物參與下PCR擴(kuò)增后的特異性片段 (見(jiàn)圖1)。

2.2 p27基因甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系106例結(jié)直腸癌患者中，p27基因甲基化陽(yáng)性率與患者的性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤大小均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);而p27基因甲基化陽(yáng)性率與結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)深度、分化程度、Dukes分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 結(jié)直腸癌患者門(mén)靜脈血p27基因甲基化與臨床病理的關(guān)系Table 1 Methylation level in p27 promoter and its relationship with clinical feature

2.3 兩組靜脈血中p27甲基化發(fā)生情況 外周靜脈血的p27基因甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示:29例對(duì)照組的甲基化陽(yáng)性率為3.4%(1/29)，結(jié)直腸癌患者外周靜脈血p27基因甲基化陽(yáng)性率為24.5%(26/106)，兩組p27基因甲基化陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=6.324，p＜0.01)。結(jié)直腸癌患者門(mén)靜脈血中p27基因甲基化陽(yáng)性率為30.2%(32/106)，與外周血p27基因甲基化陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.854，P＞0.05)。

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控因子是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的正負(fù)信號(hào)，它們之間的相互作用促進(jìn)和抑制細(xì)胞周期的正常進(jìn)程。目前越來(lái)越多的研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控失常有關(guān)，而細(xì)胞周期調(diào)控因子的異常是重要原因。p27作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直被視為候選的抑癌基因［2－3］。p27基因是一種相對(duì)分子質(zhì)量為27 kd的耐熱細(xì)胞周期抑制基因，屬kip類(lèi)，與p21、p57功能相似。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為p27基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但很少發(fā)現(xiàn)有p27基因的缺失及突變，認(rèn)為其抑癌作用可能是其產(chǎn)物p27蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平以化學(xué)劑量方式與cyclin－CDK復(fù)合物，尤其是cyclin－CDK2復(fù)合物結(jié)合，阻止細(xì)胞增殖通過(guò)限制點(diǎn)——位點(diǎn)的最關(guān)鍵因素，從而使細(xì)胞周期停止在G1期［4］。p27蛋白水平低下或缺失，可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，引起腫瘤發(fā)生。

DNA甲基化參與真核生物基因表達(dá)調(diào)控，抑癌基因的高甲基化與其失活和異常表達(dá)有關(guān)，這可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素［5－6］。近來(lái)，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化引起基因失表達(dá)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。在對(duì)多種腫瘤包括消化系腫瘤、肝癌、乳腺癌等的p27研究中，p27啟動(dòng)子區(qū)域甲基化異常與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)，提示p27低表達(dá)與結(jié)腸癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為結(jié)腸癌病理生物學(xué)行為的觀(guān)測(cè)指標(biāo)。崔靜等［7］對(duì)于98例結(jié)直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)p27基因異常甲基化是p27失活的主要機(jī)制，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。另外，乳腺癌患者檢查發(fā)現(xiàn)其組織中p27的啟動(dòng)子區(qū)域存在高甲基化狀態(tài)，且有顯著性相關(guān)［8］。藥物學(xué)研究中，使用阻遏甲基化反應(yīng)的藥物CdR對(duì)于胃癌細(xì)胞系增殖具有明顯的抑制作用，其可能的機(jī)制是p27基因的甲基化狀態(tài)得到了逆轉(zhuǎn)［9］。

在研究啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的方法中，DNA甲基化特異性PCR法具有簡(jiǎn)便易行、靈敏度高等特點(diǎn)，可用于臨床少量標(biāo)本的檢測(cè)，能為腫瘤的早期診斷、生物學(xué)行為及預(yù)后分析提供指導(dǎo)意義。

結(jié)直腸癌患者外周血p27基因甲基化水平上升，但是外周血離病灶較遠(yuǎn)，可能存在陽(yáng)性癌細(xì)胞被稀釋。為了更準(zhǔn)確地反映p27基因甲基化與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采集了與病灶更接近的門(mén)靜脈血作為甲基化水平檢測(cè)標(biāo)本。門(mén)靜脈血的甲基化陽(yáng)性率與外周血無(wú)差異。本研究探討了p27基因甲基化與結(jié)腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系，結(jié)果顯示p27基因甲基化程度與腫瘤浸潤(rùn)的深度、臨床分期、惡性程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些結(jié)果提示p27基因異常甲基化可能與結(jié)腸癌患者的臨床生物學(xué)行為有關(guān)，可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的參考指標(biāo)。

1 Migita T，Oda Y，Naito S，et al.Low expression of p27(Kip1)is associated with tumor size and poor prognosis in patients with renal cell carcinoma［J］.Cancer，2002，94(4):973－979.

2 Li M，Li JY，Zhao AL，et al.Survival stratification panel of colorectal carcinoma with combined expression of carcinoembryonic antigen，matrix metalloproteinases－2，and p27 kip1 ［J］.Dis Colon Rectum，2007，50(11):1887－1898.

3 李玉華，孫煒，孫炯.卵巢上皮癌組織中p27蛋白的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2009，12(7):1211.

4 Mitti ML，Calfano D，Troncone G，et al.Complex regnlalion of the cyclin－dependent kinase inhibitor p27kipl in thyroid cancer cells by the PIJK/AKT pathway:regulatim of p27kipI expression and localization［J］.Am J Pathol，2005，166:737 －749.

5 Lindberg D，Akerstrom G，Westin G.Evaluation of CDKN2C/p18，CDKN1B/p27 and CDKN2B/p15 mRNA expression，and CpG methylation status in sporadic and MEN1－associated pancreatic endocrine tumours［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2008，68(2):271－277.

6 Auerkari EI.Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a)，p27(Kip1)and E － cadherin in carcinogenesis［J］.Oral Oncol，2006，42(1):5－13.

7 崔靜，李庚，千新來(lái).P27基因甲基化與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及臨床生物學(xué)行為的關(guān)系［J］.新醫(yī)學(xué)，2005，36(3):145－147.

8 蔡瑜嬌，楊樺，李鵬.p27基因啟動(dòng)子甲基化在乳腺癌中的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2009，38(2):136－138.

9 王賀玲，張健，孫軍.5－Aza－CdR對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC823生長(zhǎng)及p27kipl基因異常甲基化的影響 ［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(1):120－121.