張麗莉 曹 俊 沈衛(wèi)東 朱 浩 沈永華 鄒曉平

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科（210008）

hMLH1是DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)的重要成員，可在DNA復(fù)制過程中識(shí)別和修復(fù)錯(cuò)配堿基[1,2]，以維持遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性。目前已明確MMR基因突變是遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC）的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，且在散發(fā)性結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)病中亦起一定作用[3]。本研究通過對(duì)hMLH1啟動(dòng)子區(qū)-93G/A基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，并與CRC患者的臨床病理資料行相關(guān)性分析，旨在探討其與CRC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料與方法

一、患者來(lái)源

連續(xù)收集2008年1月～2010年10月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院的住院CRC患者312例，其中男193例，女119例，年齡16～92歲，平均（61.5±15.3）歲。所有患者均排除家族性結(jié)直腸癌、肛門癌、轉(zhuǎn)移癌等其他腫瘤。284例患者病理診斷和腫瘤分期明確，其余28例無(wú)詳細(xì)臨床病理資料。納入同期無(wú)腫瘤家族史和其他遺傳性疾病史的體檢患者300例作為正常對(duì)照，其中男169例，女131例，年齡 24～79 歲，平均（56.6±12.7）歲。 兩組間性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究經(jīng)鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有入選者均知情同意。

二、方法

1.主要試劑和儀器：DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，Real-time PCR Master Mix購(gòu)自Nustar公司。TaqMan MGB探針和引物均由ABI公司合成。hMLH1-93G/A正義引物：5’-ACC CAG CAA CCC ACA GAG T-3’，反義引物：5’-GTC TAG ATG CTC AAC GGA AGT G-3’；TaqMan 探針 G：5’-FAM-TCT TCC TTC AGC TGT AG-MGB-3’，TaqMan探針 A：5’-HEX-TTC TTC CTT TAG CTG TAG CMGB-3’。Applied Biosystems 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自ABI公司。

2.TaqMan MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)基因多態(tài)性：按試劑盒說明抽提外周血白細(xì)胞DNA，水化后－80℃保存。PCR反應(yīng)體系10μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火、延伸共50 s，共50個(gè)循環(huán)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)行結(jié)果分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各基因型和等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Logistic回歸分析CRC風(fēng)險(xiǎn)，并計(jì)算優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、hMLH1-93G/A基因多態(tài)性

兩組hMLH1啟動(dòng)子區(qū)-93G/A基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡（P＝0.099，P＝0.414）（見表 1）。

二、CRC患者危險(xiǎn)因素分析

兩組GG、GA、AA基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.036，P=0.219）。

CRC患者亞組分析示Dukes A/B亞組的GG、GA基因型頻率明顯高于C/D亞組，AA基因型頻率明顯低于C/D亞組；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組的AA基因型頻率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組，GG、GA基因型頻率明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CRC患者按性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、腫瘤最大徑、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等行分層分析，各基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表 2）。

進(jìn)一步對(duì)不同Dukes分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者行等位基因分析，結(jié)果示Dukes A/B期患者的A等位基因頻率明顯低于C/D期患者，G等位基因頻率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者A等位基因頻率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，G等位基因頻率明顯降低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表 3）。

討 論

CRC高發(fā)于西方國(guó)家，近年亞洲地區(qū)CRC發(fā)病率亦不斷上升，我國(guó)的CRC發(fā)病率已接近西方國(guó)家，且有年輕化趨勢(shì)[4,5]。

CRC的病因主要包括遺傳和環(huán)境兩大因素，前者包括基因缺失、突變、甲基化、組蛋白修飾、各基因型的人群分布差異等[6]。近年，某些特定基因型人群分布差異與腫瘤易感性相關(guān)研究，已成為腫瘤遺傳學(xué)研究的新內(nèi)容。環(huán)境因素如肥胖、高脂飲食、亞硝酸鹽攝入過多、吸煙、飲酒等，對(duì)后天基因改變的作用尚未得到證實(shí)[7]。近年有研究表明hMLH1基因在CRC發(fā)生中起重要作用，提示hMLH1基因多態(tài)性可能對(duì)CRC的診斷有重要價(jià)值，但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究還較少[8]。

表1 兩組hMLH1啟動(dòng)子區(qū)-93G/A基因多態(tài)性結(jié)果分析 n（%）

表2 CRC患者危險(xiǎn)因素分析 n（%）

表3 不同Dukes分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者等位基因分析 n（%）

MMR基因hMLH1-93G/A位于核心啟動(dòng)子區(qū)，該區(qū)域存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，即NF-IL6和GT-ⅡB[9]。不同人群的hMLH1-93G/A基因型分布存在顯著差異，歐美人群以GG基因型為主[10]，本研究結(jié)果示正常對(duì)照組和CRC組的GA基因型比例高于其他基因型，與Park等[11]的研究結(jié)果一致。hMLH1-93G/A不同基因型可能通過影響其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而影響DNA的修復(fù)。Arita等[12]通過體內(nèi)足跡法證實(shí)該基因位點(diǎn)與其蛋白結(jié)合能力相關(guān)，不同基因型的蛋白結(jié)合能力不同，由此可通過改變表觀遺傳學(xué)狀態(tài)以調(diào)節(jié)hMLH1基因的表達(dá)。

hMLH1-93G/A基因多態(tài)性證實(shí)與乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸息肉等相關(guān)。韓國(guó)人群研究[12]發(fā)現(xiàn)，AA基因型者罹患鱗狀細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。GG基因型與韓國(guó)女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)[13]。Yu等[14]在美國(guó)人群中的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期吸煙者的hMLH1-93 AA和AG基因型者罹患直腸息肉、腺瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加?，F(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為肺癌等惡性腫瘤的MLH1-93A基因型與其甲基化有關(guān)[15]，轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)特異性遏制物可能通過招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶致基因甲基化、基因沉默[16,17]。上述研究提示hMLH1-93A/G基因多態(tài)性可能對(duì)CRC有修飾作用。但本研究結(jié)果示hMLH1-93G/A基因多態(tài)性與CRC的發(fā)生無(wú)關(guān)，與Campbell等[10]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)CRC患者行分層分析示，Dukes C/D期患者的A等位基因和AA基因型頻率高于A/B期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的A等位基因和AA基因型頻率亦高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，由此推斷hMLH1-93 A等位基因和AA基因型者腫瘤進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)增加，可能與啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性影響hMLH1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而影響DNA修復(fù)有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生受基因、環(huán)境等因素影響，并非某一特定基因所致。因此基因多態(tài)性研究尚不能從根本上解釋腫瘤的發(fā)生，僅能提高對(duì)腫瘤發(fā)生的認(rèn)識(shí)。本研究結(jié)果表明漢族人群hMLH1-93G/A基因多態(tài)性與CRC易感性無(wú)關(guān)，但A等位基因和AA基因型者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，提示hMLH1-93 A等位基因和AA基因型是CRC進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，但尚需大樣本研究予以驗(yàn)證。此外，本研究結(jié)果尚提示hMLH1基因多態(tài)性與腫瘤侵襲力相關(guān)，但目前尚無(wú)相關(guān)研究，可進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

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