徐張巍 許建明 石 海 梅 俏

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（230031）

結直腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，目前臨床上主要采取以手術為主的綜合性治療，由于缺乏有效的抗腫瘤血管生成靶點，迄今尚無令人滿意的生物學治療手段。動物實驗顯示，巨噬細胞游走抑制因子（MIF）缺失的ApcMin/+小鼠，腸道腺瘤數(shù)量減少，體積減小[1]，表明巨噬細胞浸潤可抑制腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。這類腫瘤相關巨噬細胞可以特異性地表達巨噬細胞金屬彈性蛋白酶（macrophage metalloelastase,MME），MME為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）家族成員之一，又名MMP-12，可降解細胞外基質(zhì)組分如彈性蛋白，是巨噬細胞穿透基底膜、浸潤腫瘤組織必不可少的活性產(chǎn)物。與其他MMPs與惡性腫瘤的侵襲、轉移相關不同，實驗[2]顯示MME能通過水解纖溶酶原產(chǎn)生血管抑素（angiostatin）抑制腫瘤血管生成，對腫瘤生長具有抑制作用。臨床研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中MME過表達的結直腸癌和胃癌患者，腫瘤血管生成減少，腫瘤侵襲受抑，預后較佳。

堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）又名FGF-2，是一種強力內(nèi)皮細胞促分裂原，參與了腫瘤血管的生成，研究[5]顯示誘導抗bFGF免疫應答可抑制小鼠結腸癌生長和腫瘤血管生成。體外實驗發(fā)現(xiàn)MME可通過產(chǎn)生血管抑素抑制bFGF介導的人微血管內(nèi)皮細胞增殖[6]，關于MME與bFGF在結腸癌細胞和實體瘤中的關系，國內(nèi)外尚未見相關報道。本研究應用小鼠結腸癌細胞皮下移植瘤模型，旨在探討MME對腫瘤組織中bFGF表達的影響，及其對結腸癌的生長抑制作用。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

6 ～ 8周齡雌性BALB/c小鼠（安徽省實驗動物中心）。免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司），MME羊抗鼠多克隆抗體、bFGF羊抗鼠多克隆抗體（Novus Biologicals），α-tubulin 單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology,Inc.）?？?RNA 提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System,Promega Corporation），第一鏈cDNA合成試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（ShineProbe? Real Time qPCR MasterMix Kits）、bFGF實時熒光定量RT-PCR引物和熒光探針（TaqMan探針）合成（上海閃晶分子生物科技有限公司）。實時熒光定量PCR儀（StepOneTMReal-Time PCR System,Applied BiosystemsTMby Life Technologies）。

二、方法

1.小鼠皮下移植瘤模型的建立：重組質(zhì)粒pEGFP-C1-MME的鑒定和穩(wěn)定轉染小鼠結腸癌細胞株CT-26以及小鼠皮下移植瘤模型的建立已在前期實驗中完成[2]。實驗設MME轉染組、空質(zhì)粒轉染組和未轉染組，每組30只小鼠。成瘤后連續(xù)測定皮下腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤體積=L（mm）×W2（mm2）×0.52，L 和 W 分別為腫瘤長徑和短徑。接種CT-26細胞4周后處死小鼠，取皮下腫瘤，予相應處理后用于后續(xù)實驗。4周內(nèi)死亡小鼠的腫瘤組織亦納入后續(xù)實驗。

2.免疫組化染色：腫瘤組織4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，行SP法免疫組化染色，操作按試劑盒說明書進行。MME和bFGF一抗稀釋比例分別為1∶100和1∶200，以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知染色陽性的切片作為陽性對照。MME的表達定位于細胞質(zhì)，胞質(zhì)呈明顯棕黃色判定為MME表達陽性；bFGF的表達定位于細胞質(zhì)和細胞膜，每張切片于高倍鏡下常規(guī)取上、下、左、右、中五個視野，每視野計數(shù)100個腫瘤細胞，平均>5%的腫瘤細胞胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色，判定為bFGF表達陽性。

3.蛋白質(zhì)印跡法：取約200 mg-80℃凍存的腫瘤組織，制備組織勻漿，離心后留取上清。將含約40μg總蛋白的樣品與等體積2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉移至PVDF膜上，封閉后依次與一抗、二抗反應，MME和bFGF一抗稀釋比例為1∶1000，內(nèi)參照α-tubulin抗體稀釋比例為1∶500。ECL顯影，BandScan 5.0凝膠圖像分析軟件行灰度掃描，分析目的蛋白相對表達量。

4.實時熒光定量RT-PCR：提取腫瘤組織總RNA，實時熒光定量RT-PCR的操作按試劑盒說明書進行。bFGF上游引物 5’-GGA GTT GTG TCT ATC AAG GGA GTG T-3’，下游引物 5’-AGC AGC CGT CCA TCT TCC T-3’，TaqMan 探 針 5’-FAMTGC CAA CCG GTA CCT TGC TAT G-TAMRA-3’。內(nèi)參照GAPDH上游引物 5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’，下游引物 5’-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3’，TaqMan 探針 5’-FAM-CCG CCT GGA GAA ACC TGC CAA GTA TG-TAMRA-3’。RT反應條件：25 ℃ 10 min，40 ℃ 60 min，70 ℃10 min。PCR反應條件：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。利用已知基因拷貝數(shù)的標準品構建標準曲線，根據(jù)目的基因和內(nèi)參照基因的標準曲線獲得 ΔCt值，2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以百分比表示，組間差異的分析采用χ2檢驗，計量資料以±sx表示，組間差異的分析采用Student t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、MME對小鼠結腸癌細胞皮下移植瘤生長的影響

皮下接種穩(wěn)定轉染MME的CT-26細胞2 ～ 3周后，MME對腫瘤生長的抑制作用逐漸顯著，4周后MME轉染組皮下腫瘤平均體積為（536.56±85.73） mm3，顯著小于空質(zhì)粒轉染組的（1411.50±97.58）mm3和未轉染組的（1309.26±104.31） mm3（P<0.001），兩對照組間則無明顯差異。

MME轉染組小鼠4周內(nèi)死亡率為3.3%（1/30），顯著低于空質(zhì)粒轉染組的26.7%（8/30）和未轉染組的20.0%（6/30）（P<0.05），兩對照組間則無明顯差異。

二、腫瘤組織MME表達

免疫組化染色示MME轉染組大片腫瘤細胞胞質(zhì)中可見棕黃色染色，而空載體轉染組和未轉染組僅腫瘤基質(zhì)中可見棕黃色染色，腫瘤細胞中未見染色（見圖1），提示MME轉染組腫瘤組織中MME呈胞質(zhì)分泌性表達。

圖1 各組腫瘤組織中MME表達免疫組化染色圖（×200）

蛋白質(zhì)印跡分析示MME轉染組腫瘤組織中可見約 57 kDa（1 Da=0.9921 u）的蛋白條帶，空載體轉染組和未轉染組則未見相應條帶（見圖2）。結合免疫組化染色結果，提示MME轉染組腫瘤組織中存在MME蛋白水平的表達。

圖2 各組腫瘤組織中MME表達蛋白質(zhì)印跡分析電泳圖

三、腫瘤組織bFGF表達

實時熒光定量RT-PCR示，空質(zhì)粒轉染組和未轉染組腫瘤組織中的bFGF mRNA相對表達量分別為MME轉染組的2.7倍和2.5倍，組間差異有統(tǒng)計學意義（0.56±0.06 和 0.53±0.07 對 0.21±0.04,P<0.01），兩對照組間則無明顯差異，提示重組MME具有抑制bFGF mRNA表達的作用。

免疫組化染色示MME轉染組腫瘤組織中bFGF蛋白表達陽性率為23.3%（7/30），顯著低于空載體轉染組的76.7%（23/30）和未轉染組的83.3%（25/30）（P<0.01），表達強度亦明顯低于兩對照組（見圖3），兩對照組間則無明顯差異。

圖3 各組腫瘤組織中bFGF表達免疫組化染色圖（×100）

蛋白質(zhì)印跡分析示三組腫瘤組織中均可見約19 kDa的蛋白條帶，MME轉染組條帶模糊，而兩對照組條帶相對清晰（見圖4）。灰度掃描分析示MME轉染組bFGF蛋白相對表達量顯著低于空質(zhì)粒轉染組和未轉染組（1.86±0.47對5.14±0.71和4.73±0.59,P<0.01），兩對照組間則無明顯差異。結合免疫組化染色結果，提示重組MME具有抑制bFGF蛋白表達的作用。

圖4 各組腫瘤組織中bFGF表達蛋白質(zhì)印跡分析電泳圖

討 論

MME為MMPs家族成員之一，與其他MMPs促進腫瘤進展的作用不同，MME對腫瘤進展具有防御作用。Houghton等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，無論是在自發(fā)性轉移模型還是實驗性轉移模型中，MME缺陷小鼠的Lewis肺癌模型肺轉移灶均顯著多于野生型小鼠；MME可在體內(nèi)減低腫瘤相關微血管密度，形成抗血管生成因素大于促血管生成因素的腫瘤微環(huán)境，從而延緩腫瘤生長，該作用不依賴于血管抑素的產(chǎn)生。Asano等[8]檢測了112例結直腸癌組織中的MMPs家族成員表達情況，發(fā)現(xiàn)未發(fā)生肝轉移者原發(fā)灶中的MME mRNA和蛋白表達顯著高于已發(fā)生肝轉移者，提示MME在抑制結直腸癌轉移方面有一定積極意義。Zhang等[9]對胃癌患者的研究亦發(fā)現(xiàn)，MME mRNA表達陽性者的淋巴結轉移率顯著低于表達陰性者，2年生存率顯著高于表達陰性者。

bFGF作為一種促分裂原和血管生成因子，可刺激內(nèi)皮細胞增殖，并通過化學激活作用誘導內(nèi)皮細胞遷移[10]，從而促進腫瘤血管生成。此外，bFGF對腫瘤細胞亦具有促增殖作用，能促進惡性腫瘤形成[11,12]。包括結腸癌細胞在內(nèi)的多種實體瘤細胞同時表達bFGF及其受體，表明bFGF可能通過自分泌作用刺激腫瘤細胞增殖[13]。一些研究提示bFGF可能為結直腸癌進展、轉移的促進因子。Dirix等[14]檢測了包括結直腸癌在內(nèi)的90例未經(jīng)治療和42例已接受治療的轉移癌患者的血清bFGF和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平，發(fā)現(xiàn)57%的未經(jīng)治療者血清bFGF和（或）VEGF水平升高；而在已接受治療者中，疾病進展者58%bFGF和（或）VEGF水平升高，對治療有應答者僅15%兩者水平升高。張陽德等[15]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性結直腸癌組織中的bFGF和VEGF mRNA表達水平與腫瘤血管侵犯、淋巴結受累、肝轉移和臨床病理分期相關。

血管抑素是重要的內(nèi)源性血管生成抑制因子，可抑制內(nèi)皮細胞增殖，對腫瘤血管生成具有強烈抑制作用。本課題組的前期實驗證實MME能在體內(nèi)促進血管抑素生成[2]，至于其是否能同時抑制腫瘤組織中bFGF的表達，從而調(diào)控結直腸癌的腫瘤血管生成，目前尚無相關報道。本實驗應用小鼠結腸癌細胞皮下移植瘤模型研究了MME對腫瘤組織中bFGF表達的影響，結果顯示接種穩(wěn)定轉染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-MME的CT-26細胞的小鼠，皮下腫瘤組織中可檢測到MME蛋白表達，實時熒光定量RT-PCR、免疫組化染色和蛋白質(zhì)印跡分析顯示MME轉染組小鼠腫瘤組織中的bFGF mRNA和蛋白表達量以及蛋白表達陽性率均顯著低于空載體轉染組和未轉染組，提示MME對bFGF的表達具有抑制作用，從而使腫瘤組織中新生毛細血管形成的連續(xù)過程受阻，因此以MME靶向拮抗bFGF可能有較好的臨床應用前景。本研究結果示MME轉染組小鼠結腸癌細胞皮下移植瘤的生長顯著受抑。

綜上所述，MME對結腸癌腫瘤血管生成的抑制作用并不是單一層面的，除促進血管抑素生成，特異性地作用于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細胞，使之萎縮、退變外，還可抑制bFGF的表達，對抗其促血管內(nèi)皮細胞增殖的作用，抑制內(nèi)皮細胞遷移并促進其凋亡，從而建立抗血管生成因素大于促血管生成因素的腫瘤微環(huán)境，以調(diào)控腫瘤血管生成，抑制結腸癌的生長、進展和轉移。

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