胡 瑩 劉玉蘭 蔡春曉 楊 靜 朱元民

北京大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科（100044）

結(jié)腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腸道炎癥密切相關(guān)[1]。炎癥性腸?。↖BD）是結(jié)腸癌發(fā)生的危險因素，IBD相關(guān)和散發(fā)性結(jié)腸癌的發(fā)生可能與菌群誘導(dǎo)的腸道低度炎癥相關(guān)[2]。結(jié)腸癌主要由結(jié)腸腺瘤發(fā)展而來，腺瘤易復(fù)發(fā)是其常見的臨床特點[3,4]，提示腺瘤患者結(jié)腸黏膜可能存在基礎(chǔ)病變。分布于腸黏膜上皮之間的腸嗜鉻（enterochromaffin,EC）細胞分泌的5-羥色胺（5-HT）與腸道炎癥密切相關(guān)，EC細胞和5-HT在腸道炎癥動物模型和IBD中表達增高[5]。5-HT與結(jié)腸腺瘤患者炎癥的關(guān)系尚未闡明。本研究通過檢測結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜炎癥相關(guān)指標和5-HT表達相關(guān)指標，旨在證實腺瘤患者存在慢性炎癥并進一步探討5-HT與腺瘤患者腸道炎癥的關(guān)系。

材料與方法

一、患者來源

選取2009年3月～2010年1月北京大學(xué)人民醫(yī)院經(jīng)結(jié)腸鏡和病理檢查確診的結(jié)腸腺瘤患者40例，并除外具有其他結(jié)腸急慢性炎性疾病以及其他部位活動性炎癥者。其中男27例，女13例；年齡39～74 歲，平均（61.2±10.0）歲；進展期腺瘤 14 例，非進展期腺瘤26例。同時選取同期17例結(jié)腸鏡檢查無異常者作為對照，并且3個月內(nèi)無急性腹瀉史、其他部位無活動性炎癥以及無糖尿病、結(jié)腸腫瘤家族史、體重指數(shù)小于25。其中男11例，女6 例；年齡 23～60 歲，平均（38.9±11.3）歲。所有研究對象均知情同意。

結(jié)腸腺瘤患者在結(jié)腸鏡下取正常黏膜組織（至少距腺瘤5 cm以上），對照組分別取升結(jié)腸和降結(jié)腸正常黏膜組織。部分組織液氮－80℃保存待測；其余置于4%甲醛溶液固定，制備石蠟包埋標本。

二、主要試劑

即用型鼠抗人嗜鉻素A（CgA）抗體、兔抗人CD3多克隆抗體、鼠兔通用型二抗試劑盒（基因有限公司）；兔抗人5-HT多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司）；實時定量SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO 公司）。

三、研究方法

1.免疫組化法：石蠟切片置于新鮮配制的3%H2O2中，室溫10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。CD3和CgA染色行抗原修復(fù)（pH值為9.0的1 mmol/L Tris-EDTA水浴加熱修復(fù)20 min），5-HT染色無需抗原修復(fù)。滴加5%的胎牛血清室溫孵育20 min。分別滴加即用型兔抗人CD3多克隆抗體、兔抗人5-HT多克隆抗體、鼠抗人CgA抗體，4℃過夜；滴加二抗室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為空白對照。

結(jié)果判斷：參照Kim等[6]的方法，每張切片選取3個視野，高倍（×400）顯微鏡下選取100個結(jié)腸上皮細胞，計數(shù)上皮內(nèi)淋巴細胞、固有層CD3+T細胞、5-HT陽性EC細胞和CgA陽性EC細胞，取均值。

2.實時熒光定量PCR：參照試劑盒說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各目的基因腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、誘生型一氧化氮合酶（iNOS）、色氨酸羥化酶 1（TpH1）PCR 引物由Invitrogen公司合成（見表1）。PCR反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，61 ℃ 20 s，72℃30 s；共 35個循環(huán)。采用BIO-RAD公司實時定量PCR儀，Opticon Monitor 3軟件分析所得數(shù)據(jù)，目的基因相對表達量的分析采用2-△CT法。

表1 PCR引物序列和擴增片段長度

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸黏膜炎癥指標

腺瘤組患者正常黏膜固有層CD3+T細胞計數(shù)較對照組顯著增高（P<0.05），上皮內(nèi)淋巴細胞計數(shù)與對照組相比無明顯差異（P>0.05）（見表 2、圖 1）。腺瘤組患者正常黏膜 TNF-α、COX-2、iNOS mRNA表達顯著高于對照組（P<0.05）（見表2）。

二、結(jié)腸黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)指標

結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜5-HT陽性EC細胞計數(shù)、CgA陽性EC細胞計數(shù)以及TpH1 mRNA表達較對照組顯著增高（P<0.05）（見圖 1、表 3）。

三、炎癥相關(guān)因子mRNA表達與TpH1 mRNA表達的相關(guān)性

結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜 TNF-α、COX-2和iNOS mRNA表達均與TpH1 mRNA表達呈正相關(guān)（r=0.373，P=0.007；r=0.539，P<0.001；r=0.539，P<0.001）。

表2 腺瘤組和對照組結(jié)腸黏膜炎癥相關(guān)指標比較（ ）

表2 腺瘤組和對照組結(jié)腸黏膜炎癥相關(guān)指標比較（ ）

組 別 例數(shù) 上皮內(nèi)淋巴細胞 固有層CD3+T細胞 TNF-α mRNA COX-2 mRNA iNOS mRNA腺瘤組 40 15.13±0.62 57.16±2.33 0.034±0.005 0.089±0.025 0.388±0.090對照組 17 13.56±0.69 40.39±2.15 0.016±0.002 0.028±0.007 0.179±0.031 P值 0.175 0.003 0.001 0.011 0.046

圖1 腺瘤組和對照組免疫組化染色圖（×400）

表3 腺瘤組和對照組結(jié)腸黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)指標比較（ ）

表3 腺瘤組和對照組結(jié)腸黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)指標比較（ ）

組 別 例數(shù) 5-HT陽性EC細胞CgA陽性EC細胞 TpH1 mRNA腺瘤組 40 4.64±0.31 7.59±0.47 1.533±0.441對照組 17 2.81±0.43 4.98±0.44 0.830±0.451 P值 0.003 0.001 0.006

討 論

19世紀，Virchow在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)白細胞，首次提出腫瘤可能起源于慢性炎癥[7]。約25%的惡性腫瘤與慢性炎癥和感染密切相關(guān)[8]。結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展亦與炎癥相關(guān)，Uronis等[9]的動物實驗表明慢性結(jié)腸炎的嚴重程度與結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)，且細菌導(dǎo)致的炎癥促使腺瘤向腺癌發(fā)展。潰瘍性結(jié)腸炎患者發(fā)病10年、20年、30年的結(jié)直腸癌發(fā)生率分別為2%、8%和18%；且結(jié)腸鏡或組織學(xué)炎癥程度越重，結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險越高[10]。多項研究[11,12]發(fā)現(xiàn)散發(fā)性結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜存在慢性炎癥，提示慢性炎癥可能是結(jié)腸腺瘤的瘤前病變。本研究中，與對照組相比，結(jié)腸腺瘤患者正常結(jié)腸黏膜固有層CD3+T細胞明顯增多，炎癥相關(guān)因子 TNF-α、COX-2、iNOS mRNA 表達亦明顯增高，說明結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜存在慢性炎癥。結(jié)腸腫瘤的發(fā)生是一個漫長的過程，高脂飲食、肥胖、年齡、感染、腸道菌群紊亂等是其危險因素，且可能與腸道慢性炎癥相關(guān)，但需進一步研究證實。

腸道暴露于大量食物、微生物、毒物等外源性抗原中，腸道免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的共同調(diào)控使腸道處于動態(tài)穩(wěn)態(tài)。當腸道黏膜穩(wěn)態(tài)失衡時，即可導(dǎo)致慢性炎癥。CgA為神經(jīng)內(nèi)分泌細胞公認的標記物[13]。分布于胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞根據(jù)其分泌激素的不同分為14種亞型，5-HT的EC細胞是胃腸道分布最廣泛、數(shù)量最多的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞[14]。5-HT與IBD、腸道感染、腸易激綜合征以及結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)；5-HT可活化免疫細胞釋放炎癥介質(zhì)，而CD4+T細胞分泌的產(chǎn)物可促進EC細胞產(chǎn)生5-HT；5-HT釋放后，由5-HT再攝取轉(zhuǎn)運體（SERT）轉(zhuǎn)運至腸道上皮細胞之后被降解[5]。Haub等[15]研究表明SERT基因缺失導(dǎo)致5-HT再攝取減少后，小鼠結(jié)腸炎加重。TpH1是5-HT合成的限速酶，主要表達于EC細胞。Ghia等[16]的研究發(fā)現(xiàn)TpH1基因缺失導(dǎo)致腸道5-HT合成減少，可減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，提示5-HT參與腸道炎癥過程。Ataee等[17]表明5-HT激動劑促進結(jié)腸癌細胞株HT29增殖，而5-HT3和5-HT4受體拮抗劑抑制HT29細胞增殖，且5-HT3和5-HT4受體在結(jié)腸癌組織中表達增高。說明5-HT可能參與結(jié)腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Nocito等[18]的研究表明TpH1基因敲除小鼠結(jié)腸腫瘤生長緩慢。本研究中，腺瘤組患者正常黏膜5-HT陽性EC細胞和CgA陽性EC細胞較對照組增多，TpH1 mRNA表達增高，并與炎癥相關(guān)因子mRNA表達呈正相關(guān)。說明結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜EC細胞增多，5-HT合成增多，并與腺瘤患者結(jié)腸黏膜炎癥相關(guān)。

Balkwill等[19]提出腫瘤發(fā)生的“達爾文微環(huán)境”，即腫瘤組織會選擇最適合腫瘤發(fā)生和發(fā)展的炎癥類型和程度。免疫細胞、細胞因子以及免疫介質(zhì)在結(jié)腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[1]。本研究初步提示，結(jié)腸腺瘤患者正常黏膜存在炎癥，其機制可能與腸道5-HT合成增加相關(guān)。說明5-HT作用環(huán)節(jié)可能作為結(jié)腸腫瘤診斷、預(yù)防、治療新的靶點，但需行進一步更深入的研究證實。

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