劉 飛,郭美麗(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室,上海 200433)

花色苷是植物體內(nèi)一類重要的次生代謝產(chǎn)物,主要是花青素的糖苷類化合物。植物之所以呈現(xiàn)出各種顏色,與花色苷有著重要的關(guān)系[1]。在植物次生代謝途徑中,花色苷代謝途徑可以算是研究較深入的一個(gè)。再加上近幾十年來(lái),突變體、重組DNA、差示掃描量熱法、遺傳位點(diǎn)標(biāo)記、蛋白質(zhì)純化、PCR擴(kuò)增等新技術(shù)和新方法的應(yīng)用,大大推動(dòng)了花色苷代謝途徑中相關(guān)酶及其編碼基因的研究。

1 花色苷相關(guān)藥學(xué)研究

花色苷類化合物易溶于極性溶劑,因此常用含有少量鹽酸或甲酸的甲醇溶液提取植物體內(nèi)的花色苷。高等植物體內(nèi)主要存在以下6種常見(jiàn)的花色苷類化合物:天竺葵色素(pelargonidin)、芍藥色素(peonidin)、矢車(chē)菊色素(cyanidin)、錦葵色素(malvidin)、矮牽牛花色素(petunidin)和飛燕草色素(delphinidin)?；ㄉ盏幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。毛細(xì)管區(qū)帶電泳、核磁共振、基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(MALDI-MS)等新的藥物分析方法,使得花色苷的分離和純化效果得到了很大提高。關(guān)于花色苷的藥理作用研究的報(bào)道很多,但主要集中在抗腫瘤、抗心血管病變和抗誘變等方面。Sarma等研究發(fā)現(xiàn),小

表1 高等植物中常見(jiàn)的6種花色素Table 1 Six common anthocyanidins in high plants

牛胸腺DNA與矢車(chē)菊色素形成的復(fù)合體能有效地防止羥基自由基(OH?)對(duì)矢車(chē)菊色素和DNA的損傷。該研究對(duì)花色苷在機(jī)體內(nèi)具有抗氧化活性提供了一種解釋。Dai等[2]對(duì)含有花色苷的黑莓提取物在提取方法、穩(wěn)定性、抗氧化活性、抗腫瘤活性及其機(jī)制等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)黑莓提取物是很具有潛力的植物藥。

2 花色苷生物代謝途徑

2.1 代謝途徑中的主要作用酶 花色苷生物代謝途徑見(jiàn)圖1,該途徑涉及以下各種酶。

圖1 花色苷生物代謝途徑Figure 1 The pathway of anthocyanin biometabolism

2.1.1 乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC) ACC催化乙酰輔酶A羧化成丙二酸單酰輔酶A。在植物體內(nèi),ACC除了在脂肪酸代謝中有顯著作用外,還參與了包括黃酮類化合物合成在內(nèi)的各種代謝途徑。Egli等[3]在玉米中分離得到了兩種ACC,分別為227 U的ACCaseⅠ和219 U的ACCaseⅡ。Shorrosh等[4]通過(guò)合成引物對(duì)cDNA的延伸和擴(kuò)增,獲得了紫花苜蓿中ACC的核酸全長(zhǎng)序列。

2.1.2 苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL) PAL催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。Olsen等[5]分析了處于蓮座期的擬南芥葉子在不同環(huán)境下4種PAL基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在環(huán)境因素觸發(fā)下黃酮類生物合成途徑中PAL1和PAL2有功能特異性。

2.1.3 肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H) C4H 催化反式-肉桂酸生成反式-4-香豆素。Ro等[6]在一種雜交白楊內(nèi)分離出了編碼C4H的cDNA,并將其導(dǎo)入到擬南芥中,通過(guò)分析找到了C4H的亞細(xì)胞定位。Achnine等[7]通過(guò)對(duì)C4H和PAL兩個(gè)在代謝途徑相承的酶的定位研究發(fā)現(xiàn),兩者有共區(qū)域化特點(diǎn)。Chen等[8]報(bào)道了對(duì)C4H的催化底物種類,并對(duì)相關(guān)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。

2.1.44 -香豆素輔酶A連接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)4CL催化4-香豆素生成4-香豆素輔酶A。Schneider等[9]找出了擬南芥的4CL的2號(hào)異構(gòu)體(At4CL2)的底物結(jié)合域(SBP),并對(duì)其進(jìn)行了功能分析。Hamberger等[10]對(duì)At4CL基因中的四個(gè)基因進(jìn)行分析,并與其他種類植物的4CL基因進(jìn)行了比較,把At4CL基因家庭從相似基因中界定出來(lái)。

2.1.5 查爾酮合酶(chalconesynthase,CHS) Kreuzaler等通過(guò)UV誘導(dǎo)荷蘭芹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)出了CHS基因。Reimold等[11]克隆出了CHS的全長(zhǎng)基因,并分析了其表達(dá)的氨基酸序列。Ferrer等[12]通過(guò)對(duì)查爾酮以及和底物結(jié)合時(shí)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了CHS的活性中心。

2.1.6 查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI) Boland等[13]從大豆種子中提純了CHI并對(duì)其理化性質(zhì)做了研究。Mehdy等[14]從大豆(Phaseolus vulgaris L.)中找到了CHI的mRNA,并比較了在不同環(huán)境因素的刺激下其表達(dá)量,得出了CHI由單基因控制并受多種環(huán)境因素影響的結(jié)論。Druka等[15]利用突變技術(shù)比較了大米(Oryza sativa)和大麥(Hordeum vulgare)的CHI的物理圖譜、遺傳圖譜和突變圖譜。

2.1.7 黃烷酮-3β-羥化酶(flavanone-3β-hydroxylase,F3H) F3H是一種非血紅素鐵酶,依賴于Fe2+、分子氧、2-酮戊二酸和抗壞血酸而起作用。Lukacin 等[16]研究發(fā)現(xiàn) ,His220、His278 和 Asp222位于F3H的離子結(jié)合區(qū)域,Arg288位于2-酮戊二酸區(qū)域。之后,他們又從矮牽牛(Petunia hybrida)中分離純化重組的F3H,并找出了Glu337-Leu338部分為該酶水解作用部位[17]。Owens等[18]完整地描述了擬南芥F3H(AtF3H)的生化特性,并通過(guò)等位基因的研究發(fā)現(xiàn),在植物體內(nèi),黃酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)和花青素合酶(anthocyanidin synthase,ANS)能在一定程度上補(bǔ)償F3H的功能。

2.1.8 二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR) Lo Piero等[19]利用突變體對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),編碼DFR的基因d f r是單克隆基因,在不同突變體中都存在,而不同的突變體有不同的顏色與d f r表達(dá)量有關(guān)。Petit等[20]通過(guò)大腸桿菌表達(dá)了葡萄(Vitis vinif era)的DFR并獲得了晶體,隨后對(duì)其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。

2.1.9 花青素合酶 ANS又名百花色素雙加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX),是一種2-酮戊二酸依賴性酶。Pelletier等[21]在擬南芥中得到一種表達(dá)序列標(biāo)簽(EST YAY780)并分析了其序列,發(fā)現(xiàn)這個(gè)EST編碼的蛋白質(zhì)序列與ANS序列有同源性。Shimada等[22]在石竹目的菠菜(Spinacia oleracea)中發(fā)現(xiàn)了與ANS功能很相似的酶并通過(guò)基因表達(dá)譜指出:只有在菠菜種子中,ANS和DFR對(duì)原花色素的合成有作用。因此他們提出了在石竹目中花青素含量較少的原因是編碼ANS和DFR的基因表達(dá)受到抑制的假說(shuō)。

2.1.10 類黃酮-3′-羥化酶(flavonoid-3′-hydroxylase,F3′H) F3′H 和 類 黃 酮-3′,5′-羥 化 酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)都屬于細(xì)胞色素P450酶,分別在黃酮類化合物B環(huán)的3′或者3′和5′位置引入羥基。這兩個(gè)酶在花色苷代謝途徑中能催化二氫黃酮醇(DHK、DHQ和DHM)的相互轉(zhuǎn)化。Seitz等[23]將紫菀科內(nèi)的7個(gè)編碼 F3′5′H的cDNA導(dǎo)入到酵母中,得到重組的蛋白質(zhì)。通過(guò)對(duì)這些蛋白質(zhì)的活性分析發(fā)現(xiàn),紫菀科的F3′5′H是單獨(dú)進(jìn)化的。Seitz等[24]利用重組基因發(fā)現(xiàn),F3′H和F3′5′H 的底物特異性主要由近 N 端區(qū)域決定,而兩者在功能上的不同主要是因?yàn)榻麮端的不同。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在487位上由Thr到Ser的保守轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致了重組的非洲菊(Gerbera hybrida)F3′H 有了5′-羥基化活性。相反地,當(dāng)由Ser轉(zhuǎn)變成 Thr時(shí),重組的F3′5′H轉(zhuǎn)變成了具有少量活性的F3′H 。

2.1.11 花色苷?；D(zhuǎn)移酶(anthocyanin acyltransferases,AATs) 根據(jù)乙酰基的供體不同,AAT s可分為兩大類:脂肪族類和芳香族類。Nakayama等[25]通 過(guò) 對(duì) Ss5MaT1、Ss5MaT2、Dv3MaT、Sc3MaT、Pf5MaT、Gt5AT 和 Pf3AT 的氨基酸對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),AATs的序列中含有基序1(-His-Xaa3-Asp-)和基序 3(-Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-)。通過(guò)將Dv3MaT的cDNA引入到矮牽牛中,Suzuki 等[26]發(fā)現(xiàn) ,6′-O-丙二?；?cyanidin 3-O-glucoside能有效地防止β-糖基化,這說(shuō)明丙二酰化是花色素保持穩(wěn)定的一種方式。

2.1.12 花色苷甲基轉(zhuǎn)移酶(anthocyanin methyltransferases) 甲基化在花色苷代謝途徑中研究得不多?；ㄉ罩?只有矢車(chē)菊色素和飛燕草色素存在甲基化反應(yīng)。甲基化主要能讓花色苷更加穩(wěn)定地存在。Jonsson等[27]在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)基因Mr1、Mt2、Mf 1和M f2分別控制4種甲基轉(zhuǎn)移酶的合成。

2.1.13 花色苷糖基轉(zhuǎn)移酶(anthocyanin glycosyltransferases) 在花色苷糖基化修飾中,主要有F3GT(UDP-Glc:anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase orUDP-Glc:flavonoid 3-O-glucosyltransferase),A5GT(UDP-Glc:anthocyanin 5-O-glucosyltransferased),A3′GT(UDP-glucose:anthocyanin 3′-O-glucosyltransferase),A3RT(UDP-rhamnose:anthocyanidin 3-O-glucoside-O-rhamnosyltransferase)和 A3′5′GT(UDP-glucose:anthocyanin 3′,5′-O-glucosyltransferase)等糖基轉(zhuǎn)移酶起作用。Gerats等[28]通過(guò)雜交的方法,研究了矮牽牛中基因An1、An2、和 An4對(duì)F3GT酶活性的影響。Ford等[29]分離出了一種葡萄(Vitis vini f era)的F3GT。酶代謝動(dòng)力分析的結(jié)果顯示,該酶催化矢車(chē)菊色素的kcat是其催化黃酮醇槲皮素的48倍。Yamazaki等[30]利用差顯技術(shù)克隆出了紫蘇(Perilla f rutescens)的A5GT的cDNA,并驗(yàn)證了其功能。Fukuchi-Mizutani[31]從三花龍膽(Gentiana tri f lora)中提純了A3′GT,并根據(jù)其氨基酸殘基分離出了cDNA。通過(guò)對(duì)A3′GT的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),該酶有嚴(yán)格的底物特異性,只能對(duì)與飛燕草色素有相似結(jié)構(gòu)、在3位和5位上有Glc基團(tuán)的花色苷的3′位的羥基進(jìn)行糖基化。A3RT將3-花色素糖苷轉(zhuǎn)化成3-花色素蘆丁苷。Kogawa等[32]在蝶豆(Clitoria ternatea)中分離提純了A3′5′GT,該酶主要在飛燕草苷元-3-O-(6″-O-丙二酰)-β-葡萄糖苷 3′位和 5′位葡萄糖苷化的過(guò)程中起作用。

2.2 酶的亞細(xì)胞定位和酶復(fù)合物的研究 早在1978年就有關(guān)于花色苷代謝途徑中相關(guān)酶的亞細(xì)胞定位的研究。Hrazdina等[33]對(duì)朱頂紅屬(Hippeastrum)和郁金香屬(Tulipa)植物原生質(zhì)體的各亞細(xì)胞組分中二氫黃酮合酶、CHI和A3GT三種酶的活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,在細(xì)胞質(zhì)中這三種酶的活性最高。Wurtele等[34]發(fā)現(xiàn)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在高粱(Sorghum bicolor)種子的表皮細(xì)胞中的活性與質(zhì)體有關(guān)。關(guān)于花色苷途徑的上游階段起作用的酶的亞細(xì)胞定位也有不少研究。PAL主要存在于細(xì)胞壁內(nèi),C4H則能在葉綠體和細(xì)胞核內(nèi)找到,4CL主要存在于二次增厚的細(xì)胞壁和中果皮維管束組織的薄壁細(xì)胞中[35]。在研究代謝酶的亞細(xì)胞定位過(guò)程中發(fā)現(xiàn),這些酶往往是以酶復(fù)合物的形式起催化作用 在1985,關(guān) 丙醇和黃酮類化合物代謝途徑中的酶是以酶復(fù)合物形式起作用的觀點(diǎn)就被提出來(lái)了。Burbulis等[36]發(fā)現(xiàn)CHS、CHI和DFR相互作用有方向依賴性,并通過(guò)親和色譜和免疫共沉淀法在擬南芥種子中進(jìn)一步確證了它們之間的相互作用。

3 總 結(jié)

作為一類很有潛力的藥用天然化合物,花色苷以其分布廣、含量高、活性強(qiáng)、作用多樣性的特點(diǎn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注,對(duì)花色苷的研究也不斷得到可喜的進(jìn)展,特別是在其生物代謝過(guò)程的研究中不斷有新發(fā)現(xiàn)。對(duì)代謝途徑中主要代謝酶的研究,已獲得大量的文獻(xiàn)資料。而對(duì)花色苷代謝下游途徑的研究,特別是一些修飾酶的研究則相對(duì)較少。目前,關(guān)于花色苷的臨床作用的研究對(duì)象往往是一些富含花色苷的植物提取物,并非單體化合物。而通過(guò)花色苷代謝途徑的研究就有可能有目的地改變某一單體化合物的含量,從而為單體化合物的研究打下基礎(chǔ)。隨著研究方法的改進(jìn),一些新的代謝途徑可能會(huì)被發(fā)現(xiàn),一些新的、高藥效并且能穩(wěn)定存在于人體內(nèi)的花色苷類化合物可能會(huì)被發(fā)掘出來(lái)。

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