汪學(xué)英，孫明偉，顧 鋒，吳金男，尹 凡

（常熟理工學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

微生物對(duì)食品的污染問(wèn)題是我國(guó)乃至全世界食品安全中最突出的問(wèn)題.牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，但易腐敗、變質(zhì)[1]，其中含有很多潛在的有害微生物，這些微生物可以破壞牛奶質(zhì)量，危害飲用者身體健康[2-4].細(xì)菌總數(shù)既是評(píng)價(jià)牛奶質(zhì)量最重要的污染指標(biāo)之一，也是最主要的質(zhì)量控制項(xiàng)目，建立及時(shí)、準(zhǔn)確、快速、適用于奶站收購(gòu)時(shí)“卸載”檢測(cè)的牛奶中微生物檢測(cè)方法是牛奶衛(wèi)生檢驗(yàn)中的一個(gè)十分重要的內(nèi)容.

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)非常繁瑣，需要耗費(fèi)大量的人力物力，而且檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，難以滿(mǎn)足目前國(guó)內(nèi)外對(duì)食品安全檢測(cè)的要求[5，6].串連式壓電傳感器因具有穩(wěn)定、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[7，8]，已被應(yīng)用于微生物的檢測(cè)[9，10]，但已有的文獻(xiàn)都集中在串連式壓電傳感器對(duì)單一菌種的測(cè)定[11-13].本實(shí)驗(yàn)是基于在微生物作用下牛奶發(fā)生凝結(jié)，使牛奶的粘密度發(fā)生變化從而使石英晶體諧振頻率發(fā)生突變，而凝固的時(shí)間與牛奶中微生物的初始濃度存在線(xiàn)性關(guān)系，因此通過(guò)檢測(cè)牛奶凝結(jié)時(shí)間可以實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中總菌數(shù)的間接測(cè)定.本方法的準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相當(dāng)，但更快速、簡(jiǎn)便.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

石英晶體微天平（QCM922，Seiko，Japan）、9MHz的 AT切型石英晶片（Seiko，Japan）；凈化工作臺(tái) S·SW-CJ·2F型（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；全自動(dòng)不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器YX.400Z型（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；電熱恒溫干燥培養(yǎng)箱303A-3S型（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；PHS－3C型pH計(jì)（上海精密儀器廠）.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）由常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心提供.

培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121℃高壓滅菌20分鐘.牛奶：常熟市圣力乳業(yè)有限公司和市售.實(shí)驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

儀器檢測(cè)：用濃硫酸和雙氧水（3:1）的混合液處理電極表面，蒸餾水沖洗凈后吹干，連同檢測(cè)池在75%酒精中浸泡，無(wú)菌水沖洗，加入一定量的滅菌牛奶.檢測(cè)電極插入檢測(cè)池中，待溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，用無(wú)菌微量進(jìn)樣器或吸量管向檢測(cè)池中接入不同濃度的細(xì)菌懸液，開(kāi)機(jī)檢測(cè).設(shè)定每5 min一個(gè)點(diǎn)，跟蹤測(cè)定，得到一系列數(shù)據(jù).

平板實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行，作為對(duì)照.對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)『线m的稀釋樣1 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每梯度做3個(gè)平行，加入融化并冷卻至50℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基并搖勻，待凝固后置于37℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，然后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，推算樣品中細(xì)菌濃度.

以上操作均于無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

壓電傳感器不僅對(duì)質(zhì)量敏感，而且對(duì)液體的力學(xué)性質(zhì)，如粘度、密度、應(yīng)力、彈性模量等的變化也非常敏感[7].壓電石英晶體諧振頻率的改變值與介質(zhì)的密度和粘度之間的關(guān)系可用如下公式[7]表示：

上式表明，△f隨（ρLηL）1/2增加而降低（式中ρL、ηL分別為介質(zhì)的密度和粘度，ρq為石英晶體密度，μq為石英剪切模量）.

作為液相介質(zhì)的鮮乳在微生物作用下發(fā)酵產(chǎn)酸，牛奶的流變性和粘度發(fā)生變化，從而產(chǎn)生凝結(jié)現(xiàn)象.由于粘、密度增大，引起壓電晶體石英晶振的頻率下降.當(dāng)開(kāi)始凝結(jié)時(shí)頻率急降，這個(gè)頻率急降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)定義為檢測(cè)時(shí)間（FDT）.微生物含量越多，到達(dá)FDT所需的時(shí)間越短，兩者存在如下關(guān)系[7]：

圖1為牛奶凝結(jié)的典型頻率響應(yīng)曲線(xiàn).其中曲線(xiàn)a是無(wú)菌的空白對(duì)照組，b、c為在滅菌奶中約加入含4.2×105cfu/mL嗜熱鏈球菌后的典型頻移曲線(xiàn).開(kāi)始由于細(xì)菌剛接種到牛奶中，處于適應(yīng)期，所以代謝十分緩慢，頻率基本不發(fā)生變化.一段時(shí)間后，細(xì)菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌大量繁殖，在細(xì)菌作用下，牛奶發(fā)酵產(chǎn)酸而凝結(jié)，此時(shí)頻率開(kāi)始急劇下降，直線(xiàn)1、2所對(duì)應(yīng)的為約含4.2×105cfu/mL嗜熱鏈球菌的牛奶在37℃和21℃時(shí)的頻率檢測(cè)時(shí)間（FDT）.空白組由于沒(méi)有細(xì)菌加入，所需凝結(jié)時(shí)間較長(zhǎng)，在21℃時(shí)10小時(shí)仍未觀察到凝結(jié)現(xiàn)象；而當(dāng)有約4.2×105cfu/mL細(xì)菌存在時(shí)，37℃時(shí)牛奶的凝結(jié)時(shí)間僅為1.5小時(shí)左右（見(jiàn)曲線(xiàn)c），而21℃時(shí)約需6小時(shí)才開(kāi)始凝結(jié)（見(jiàn)曲線(xiàn)b）.由此可見(jiàn)，培養(yǎng)條件不同，F(xiàn)DT也不同.只有在培養(yǎng)條件相同、傳代速度穩(wěn)定時(shí)，細(xì)菌初始數(shù)目越大FDT值才越小，因此相同條件下可以通過(guò)測(cè)定頻率發(fā)生變化的時(shí)間來(lái)間接測(cè)定細(xì)菌的初始數(shù)目.

圖1 牛奶凝結(jié)的典型曲線(xiàn)

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

壓電傳感器用于生物反應(yīng)液相檢測(cè)過(guò)程受到多種因素的影響，常見(jiàn)的影響因素如溶液的離子濃度、粘度、密度、pH值、體積、溫度等[14].故本文實(shí)驗(yàn)選取對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)及活性影響較大的pH值和溫度進(jìn)行探討.

露置牛奶在空氣中一定的時(shí)間以使細(xì)菌滋生，在9 ml的滅菌牛奶中加入1 ml上述處理的牛奶，在不同溫度下考察其頻率響應(yīng)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可以看出，溫度對(duì)細(xì)菌的活性影響較大，曲線(xiàn)a、b、c、d分別為30℃、37℃、42℃和45℃時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)頻率曲線(xiàn).隨著溫度的升高，F(xiàn)DT逐漸減小.造成這一結(jié)果可能的原因是隨著溫度的升高，細(xì)菌增殖速度較快，大量產(chǎn)酸，使牛奶迅速凝結(jié)，介質(zhì)的流變性、粘密度發(fā)生變化.另外溫度的變化對(duì)測(cè)定介質(zhì)-牛奶的理化特性也有一定的影響.但溫度太高儀器不太穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)選取42℃作為檢測(cè)溫度.

檢測(cè)介質(zhì)的初始pH值對(duì)檢測(cè)時(shí)間FDT也有較大的影響.在9 ml滅菌牛奶中加入1 ml含菌牛奶，用檸檬酸和檸檬酸鈉固體調(diào)節(jié)pH值，圖3為不同pH值下相同濃度細(xì)菌的頻移曲線(xiàn)，從圖3可以看出，pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響. 曲線(xiàn)c（pH＝7.4）、d（pH＝8）斜率較曲線(xiàn)a（pH＝5.6）、b（pH＝6.8）大，說(shuō)明介質(zhì)的pH值越大，頻率下降越快，且最大頻移也較大.而pH值為6.8時(shí)的FDT最?。ㄝ^pH＝5.6時(shí)的FDT縮短了約140分鐘），說(shuō)明此時(shí)牛奶中的主要細(xì)菌生長(zhǎng)較旺盛.實(shí)驗(yàn)選取了FDT較短時(shí)的pH值為6.8的介質(zhì)為實(shí)驗(yàn)介質(zhì).

圖2 不同溫度下細(xì)菌的頻移曲線(xiàn)

圖3 不同pH下相同濃度的細(xì)菌的頻移曲線(xiàn)

實(shí)驗(yàn)還考察了無(wú)機(jī)鹽對(duì)檢測(cè)時(shí)間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中無(wú)機(jī)鹽用量對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響.

2.3 細(xì)菌含量的測(cè)定

圖4為在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，采用方法1.3對(duì)接種了不同濃度細(xì)菌后的試樣進(jìn)行測(cè)定所得到的頻率變化曲線(xiàn)，從圖4可以看出，加入細(xì)菌量越多，牛奶凝結(jié)所需的時(shí)間越短，即FDT越小.實(shí)驗(yàn)測(cè)試了一系列含不同濃度細(xì)菌的鮮乳，得到了校準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程為：

FDT（min）=662.36-94.75lgc（cfu/mL），R=-0.9963

上式中的C是檢測(cè)液中細(xì)菌的初始濃度，F(xiàn)DT是頻率檢出時(shí)間，相關(guān)系數(shù)為0.9963，在細(xì)菌濃度為5.5×102-1×106cfu/mL范圍內(nèi)，F(xiàn)DT和細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù)成良好的線(xiàn)性關(guān)系.根據(jù)上述公式，就可以由實(shí)驗(yàn)得到的FDT值計(jì)算出被檢樣品的細(xì)菌含量.

實(shí)驗(yàn)中所使用的細(xì)菌儲(chǔ)備液的濃度由平板計(jì)數(shù)法獲得，系列濃度的菌液由儲(chǔ)備液用滅菌乳稀釋一定倍數(shù)而成.

圖4 不同濃度細(xì)菌的頻率響應(yīng)曲線(xiàn)

2.4 本文方法與平板計(jì)數(shù)法的比較

取5份牛奶樣品（市售），分別用壓電傳感器和平板計(jì)數(shù)法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定.先用平板計(jì)數(shù)法對(duì)5份樣品進(jìn)行檢測(cè).然后使用本文方法對(duì)每個(gè)奶樣平行測(cè)定5次，取其平均值與平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 本文方法與平板計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果（n=5）

從表1數(shù)據(jù)可以看出，用兩種方法測(cè)定5個(gè)樣品的最大相對(duì)偏差為6.94%；同時(shí)也可計(jì)算出t=2.1207，當(dāng)自由度v=n-1=4，由 v=4查 t值表得 t值：t0.05（4）=2.776，t0.01（4）=4.604，今 t＜t0.05，故兩種方法差異不顯著，說(shuō)明本文方法用于牛奶中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定是可行的.

3 結(jié) 論

本文應(yīng)用壓電傳感器測(cè)定了牛奶中總菌數(shù)，樣品不需要預(yù)處理，操作方便、靈敏、檢出限低，并與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異.但本方法由于檢出時(shí)間的讀取存在誤差，且不同類(lèi)型的細(xì)菌其響應(yīng)特征有所不同，因此，對(duì)混合細(xì)菌的測(cè)定可能存在一定的誤差，但本方法作為牛奶初步篩選的方法，可大大縮短檢測(cè)時(shí)間，在微生物的快速檢測(cè)中具有優(yōu)勢(shì).

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