吳金男，王玉婷

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）來源于藍(lán)藻，對(duì)人和水生動(dòng)植物具有很強(qiáng)的毒性及潛在危害，目前的環(huán)境檢測(cè)已經(jīng)把其列為其中的一個(gè)指標(biāo)，但是如何既能準(zhǔn)確又能迅速地定性定量檢測(cè)出是人們普遍關(guān)注的問題.MC是一類單環(huán)七肽毒素，至今已發(fā)現(xiàn)60多種異構(gòu)體[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中一個(gè)特殊的氨基酸側(cè)鏈——Adda（5位）是微囊藻毒素活性所必需的，而2、4位取代基不同和空間結(jié)構(gòu)上的微小差異將導(dǎo)致毒性上的較大差別.水體中最常見的微囊藻毒素是MC-RR、MC-YR、MC-LR，其中MC-LR毒性大于MC-RR、MC-YR[2].世界衛(wèi)生組織（WHO）和我國的飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，MC-LR的含量不得超過1.0 g/L[3，4].目前水體中MC的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[5-8]和酶聯(lián)免疫法[9，10]等，其中以HPLC法應(yīng)用最為普遍[11，12].

隨著太湖水域藍(lán)藻水華的頻繁爆發(fā)，微囊藻毒素對(duì)環(huán)境和人類健康的潛在影響已越來越受到關(guān)注.HPLC其樣品前處理步驟較為繁瑣，費(fèi)時(shí)較長.本文通過樣品處理步驟簡化后的HPLC對(duì)水產(chǎn)品中富集的微囊藻毒素進(jìn)行檢測(cè)，建立水產(chǎn)品中微囊藻毒素的測(cè)定方法.

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：黑色大頭鰱魚，體重2.5 kg，購于常熟市水產(chǎn)市場(chǎng)，用于富集微囊藻毒素.

主要試劑：微囊藻毒素MC-LR，MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品（購自美國Sigama公司），粗毒素（由藍(lán)藻干制藻粉中用甲醇提取的粗提毒素），甲醇（色譜純），甲醇（分析純），乙酸，正丁醇，正己烷等.

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（1100 series Agilent），超聲波清洗器（KQ-600E，昆山市超聲儀器有限公司），離心機(jī)（Biofuge stratos SORVALL.USA），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000，上海亞榮生化儀器廠），SPEC18固相萃取柱（美國WATERS公司），氮吹儀（Organomation Associates Jnc），移液槍200 μL/1mL/5mL（dragon-med），電子精密天平（AR1530，奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高效液相色譜檢測(cè)條件及流動(dòng)相的選擇

高效液相色譜儀為Agilent 1100系列，使用C18反相色譜柱，柱溫40℃，進(jìn)樣時(shí)間20 min，波長238 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μl[13].選擇甲醇水溶液及添加0.05%三氟乙酸的甲醇水溶液作為流動(dòng)相.

1.3.2 樣品準(zhǔn)備

將購買的大頭鰱魚洗凈，魚肉片取上下兩片，脊柱、魚鰭、魚尾、魚刺均棄去不用.洗凈切丁，放入攪拌機(jī)內(nèi)，攪碎成肉漿狀.將打碎魚肉肉漿分裝在25個(gè)樣品袋中，冷藏待用.

1.3.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇及樣品檢測(cè)

稱取魚肉肉漿約5 g于離心管中，用溶劑直接提取毒素.另外在樣品中人為添加毒素，再用溶劑提取毒素.每管中添加粗毒素（7 mg/L～8 mg/L）1 mL，溶劑15 mL，振蕩，攪拌，超聲15 min.接著12000 r/min離心12 min，收集上清液.共重復(fù)3次.提取微囊藻毒素的溶劑分別為5%乙酸溶液（v/v），75%甲醇溶液（v/v），丁醇-甲醇-水溶液（v/v/v=1∶4∶15）.其中，5%乙酸提取上清液直接過SPEC18柱；75%甲醇提取上清液，旋蒸，去甲醇；正丁醇-甲醇-水（1∶4∶15）提取上清液，移入分液漏斗中，加15 mL正己烷，振蕩分層，取水相.

提取液過柱，每個(gè)小柱先用5 mL甲醇潤洗，然后用5 mL單蒸水潤洗，上樣，2 mL單蒸水洗脫，再用2 mL 20%甲醇洗脫，最后用4 mL 80%甲醇洗脫，收集于5 mL玻璃定量管中，得到藻毒素甲醇溶液.將所得溶液過0.2 μm有機(jī)系濾頭，取濾液待測(cè).用HPLC對(duì)樣液進(jìn)行測(cè)定.

由于魚體樣品生活水域非藍(lán)藻高發(fā)區(qū)，其中毒素含量可能極低，故在實(shí)際樣品檢測(cè)中，分別進(jìn)行了本底樣品、添加粗提純毒素樣品、純粗毒素的毒素含量檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

在魚肉中加入毒素，用75%甲醇超聲提取15 min，離心取上清液，旋蒸去甲醇，得到粗毒素的魚肉樣品提取液.選擇甲醇水溶液以及添加0.05%三氟乙酸的甲醇水溶液作為分離微囊藻毒素的流動(dòng)相.結(jié)果表明，添加0.05%三氟乙酸的55%甲醇作為流動(dòng)相，能得到特征峰最大出峰面積、特征峰與雜質(zhì)峰分離程度最顯著，出峰效果最好.

圖1 55%的甲醇流動(dòng)相出峰圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用甲醇（色譜純）溶解MC-LR和MC-RR并等量混合.混合標(biāo)準(zhǔn)毒素溶液繼續(xù)用甲醇（色譜純）稀釋，配制濃度分別為10.00 mg/L、5.00 mg/L、2.00 mg/L、1.00 mg/L、0.50 mg/L、0.25 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)毒素溶液，在液相色譜條件下測(cè)定，以進(jìn)樣濃度與相對(duì)應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，考察其相關(guān)系數(shù).每個(gè)濃度做兩個(gè)平行進(jìn)樣.檢測(cè)結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2和圖3.

結(jié)果表明，進(jìn)樣濃度與特征吸收峰面積在0.25 mg/L～2.00 mg/L間具有線性關(guān)系.由進(jìn)樣濃度0.25 mg/L到2.00 mg/L制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，MC-LR和MC-RR兩種毒素的進(jìn)樣濃度與相對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.999.

2.3 穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)

為衡量儀器的平行進(jìn)樣穩(wěn)定性，試驗(yàn)中選取2 mg/L濃度毒素標(biāo)品進(jìn)行六次平行進(jìn)樣.結(jié)果表明，MC-RR、MC-LR平行進(jìn)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2%、5%，說明使用的儀器具有較好的平行進(jìn)樣穩(wěn)定性.

2.4 微囊藻毒素提取溶劑的選擇

相對(duì)于天然水體或飲用水而言，魚肉樣品的基質(zhì)要復(fù)雜得多.在樣品基質(zhì)中除了含有藻毒素外，還含有大量的蛋白、脂肪等雜質(zhì)，難以采用水體中微囊藻毒素檢測(cè)方法的樣品處理方法[4，5]，在樣品提取過程中必須盡可能地除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì).為了獲得理想的提取率和凈化效果，試驗(yàn)中觀察了5%乙酸溶液（v/v），75%甲醇溶液（v/v），丁醇-甲醇-水溶液（v/v/v=1∶4∶15）提取微囊藻毒素的效果.

表1 MC-RR、MC-LR毒素標(biāo)品進(jìn)樣結(jié)果

圖2 MC-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 MC-LR標(biāo)準(zhǔn)曲線

由于5%乙酸溶液提取上清液中含大量膠狀粘液物質(zhì)，堵塞SPEC18柱，導(dǎo)致富集過程無法進(jìn)行，該提取劑舍去不用.其他樣液注入高效液相色譜儀進(jìn)樣口，經(jīng)流動(dòng)相在C18反相萃取柱上萃取分離，得樣品出峰圖.

分析出峰結(jié)果，本底樣品中毒素含量低于儀器檢測(cè)限，無法檢出.添加毒素樣品中，75%甲醇，正丁醇-甲醇-水（1∶4∶15）提取劑都表現(xiàn)出較好的雜質(zhì)分離效果，其中，75%甲醇提取劑對(duì)應(yīng)特征峰面積較大，表明所得提取液中毒素含量高，是最佳提取溶劑.

2.5 樣品檢測(cè)

表2 微囊藻毒素標(biāo)品平行進(jìn)樣結(jié)果（進(jìn)樣濃度2 mg/L）

在實(shí)際樣品檢測(cè)中，分別對(duì)本底樣品、添加粗提純毒素樣品以及純粗毒素樣品的毒素含量檢測(cè).

2.5.1 本底樣品和添加毒素樣品的檢測(cè)

結(jié)果（見表3、圖6～圖8）表明，本底樣品中毒素含量低于高效液相色譜儀檢測(cè)下限，故待測(cè)樣品中毒素含量忽略不計(jì).

表3 添加毒素樣品進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果

由于樣品最初添加1 mL毒素，最終用4 mL甲醇收集，被稀釋了4倍，故回歸到最初濃度需將得到的濃度擴(kuò)大4倍.

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由MC-RR、MC-RR峰面積得到其相應(yīng)濃度.

MC-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=68.179X－19.81（Y:峰面積，X:進(jìn)樣濃度/mg·L-1）.

MC-LR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=31.508X－9.4648（Y:峰面積，X:進(jìn)樣濃度/mg·L-1）.

圖4 7 5%甲醇提取劑提取添加毒素樣品中毒素出峰圖

圖5 正丁醇-甲醇-水（1：4：15）提取劑提取添加毒素樣品中毒素出峰圖

圖6 本底樣品高效液相色譜檢測(cè)出峰圖

圖7 添加毒素樣品高效液相色譜檢測(cè)出峰圖（平行樣1）

2.5.2 微囊藻毒素粗毒素檢測(cè)

由于粗毒素中MC-RR，MC-LR含量較高，有7～8 mg/L，不在所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)，故將其稀釋6倍，再進(jìn)入高效液相色譜儀檢測(cè).由于取出的1 mL粗毒素已被稀釋，同樣，這里計(jì)算出的毒素濃度最終也回歸到最初濃度，方便計(jì)算.檢測(cè)結(jié)果見表4、圖9.

2.5.3 加標(biāo)回收率計(jì)算

實(shí)際樣品檢測(cè)加標(biāo)回收率計(jì)算：

3 結(jié) 論

圖8 添加毒素樣品高效液相色譜檢測(cè)出峰圖（平行樣2）

圖9 粗毒素高效液相色譜檢測(cè)出峰圖

表4 粗毒素進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果

采用添加微囊藻毒素粗提純品的方法，觀察不同樣品前處理方法和色譜條件下，對(duì)微囊藻毒素MC-RR，MC-LR的檢出能力以及排除雜質(zhì)的干擾，建立快速準(zhǔn)確的對(duì)魚體樣品中微囊藻毒素的HPLC.結(jié)果表明，75%甲醇溶液的提取效果要優(yōu)于其他提取方法，提取效率最高.添加0.05%三氟乙酸的55%甲醇作為流動(dòng)相，能得到特征峰最大出峰面積、特征峰與雜質(zhì)峰分離程度最顯著，出峰效果最好.MC-RR的回收率為84.1%，MC-LR的回收率為89.9%，MC-RR和MC-LR的平行進(jìn)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2%和5%，建立的SPE-HPLC分析微囊藻毒素的方法具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高、方法穩(wěn)定、回收率較高、操作簡單等特點(diǎn)，可以作為水產(chǎn)品中微囊藻毒素檢測(cè)的一種方法.

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