任彩玲 王學(xué)柱 張鈞

1 江西省贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院（贛州 341000）

2 解放軍國(guó)際關(guān)系學(xué)院軍事與體育教研室

3 揚(yáng)州大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)研究所

目前研究已經(jīng)證實(shí)[1，2]，熱休克蛋白 90（HSP90）在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和血流動(dòng)力障礙中起到重要的作用，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)NOS的成熟、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和活性，增加NO的釋放。在多種組織，如心肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，運(yùn)動(dòng)可以引起HSP表達(dá)的變化，但在主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中是否也存在這樣的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，HSP90對(duì)心血管系統(tǒng)作用的研究結(jié)果提示[3]，血管內(nèi)皮細(xì)胞的HSP90可以作為一種治療心血管疾病的藥物作用靶點(diǎn)。與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的心血管功能改善是否與運(yùn)動(dòng)后主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90表達(dá)有關(guān)呢？本研究觀察了長(zhǎng)期游泳運(yùn)動(dòng)后自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90表達(dá)變化，并分析其與主動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及喂養(yǎng)

選用8只6周齡雄性Wistar大鼠為正常對(duì)照組，16只6周齡雄性SHR大鼠[均由北京維通利華公司提供，SCXK（京）2007-0001]，體重 170 ～ 200 g，隨機(jī)分為SHR運(yùn)動(dòng)組和SHR對(duì)照組，每組8只。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，飼養(yǎng)籠選用塑料制品并配不銹鋼罩、塑料吸水瓶和不銹鋼吸水管，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固定混合飼料喂養(yǎng)，各組大鼠每天自由進(jìn)食飲水。室溫22～24℃，濕度為40～60%，自然光照。

1.2 訓(xùn)練方案

SHR運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行90 min無(wú)負(fù)重有氧游泳運(yùn)動(dòng)。游泳缸體積為150 cm×60 cm×70cm，水深60 cm，內(nèi)壁光滑，水溫31±1℃。適應(yīng)性游泳1周，時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min，以后每次游泳90 min，每周6次，持續(xù)8周。SHR對(duì)照組及正常對(duì)照組均不運(yùn)動(dòng)，分籠飼養(yǎng)，均自由進(jìn)食飲水。

1.3 取材與指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 血壓測(cè)定

采用RBP-I型大鼠血壓心率測(cè)定儀（中日友好醫(yī)院臨床研究所）每周測(cè)定所有大鼠血壓1次。為減少測(cè)量中的誤差，在首次測(cè)量前，將SHR裝入固定網(wǎng)套內(nèi)，裝上尾套，每天適應(yīng)性固定30分鐘，共持續(xù)1周，之后再進(jìn)行第一次測(cè)量，且連續(xù)測(cè)量3天取平均值作為其初始血壓值。

1.3.2 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90檢測(cè)

按Jaffe等[4]的方法稍加改進(jìn)，采用外翻膠原酶消化法分離主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞：大鼠在末次游泳后24小時(shí)，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后剖開(kāi)腹腔，分離主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈分支處，在靠近髂總動(dòng)脈分支處截取1.5 cm長(zhǎng)血管，取出放入D-Hanks液中。無(wú)菌剝除血管外膜的脂肪和纖維組織并稱重，D-Hanks液沖洗血管腔。將血管移入另一有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用鑷子將血管外翻，使內(nèi)膜暴露出來(lái)，用滅菌線將血管兩端扎緊。將血管轉(zhuǎn)移到含有2.5g/L Ⅱ膠原酶的培養(yǎng)皿中，放入37℃水浴箱中，分別于15 min、30 min、45 min、60 min、2 h收集膠原酶，1500 r/min離心10 min，棄上清，用PBS洗滌1次，即得到分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

采用ELISA方法檢測(cè)主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒要求操作，原裝試劑盒由美國(guó)ADL公司提供。然后以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為縱坐標(biāo)，以濃度（標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 ng/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性為P < 0.05，非常顯著性為P < 0.01。

2 結(jié)果

2.1 血壓

由表1可知，實(shí)驗(yàn)前兩SHR組血壓均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.01），但兩SHR組之間血壓無(wú)顯著性差異；8周實(shí)驗(yàn)后，兩SHR組血壓均顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.01），SHR運(yùn)動(dòng)組血壓顯著低于SHR對(duì)照組（P < 0.01）。

表1 3組大鼠血壓比較（mmHg）

2.2 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90表達(dá)

由表2可知，8周實(shí)驗(yàn)后，SHR運(yùn)動(dòng)組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90含量顯著高于SHR對(duì)照組（P < 0.05）。

3 討論

表2 3組大鼠HSP90表達(dá)比較

有關(guān)運(yùn)動(dòng)與高血壓之間關(guān)系的研究表明[5]，長(zhǎng)期中等強(qiáng)度有規(guī)律的運(yùn)動(dòng)能降低患者安靜時(shí)血壓，對(duì)高血壓有一定的防治作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHR運(yùn)動(dòng)組大鼠血壓較SHR對(duì)照組顯著下降，且SHR運(yùn)動(dòng)組大鼠血壓在第5周時(shí)與SHR組相比已有顯著性差異。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)有一定的降壓作用，能有效抑制血壓進(jìn)一步升高。8周游泳運(yùn)動(dòng)后，SHR運(yùn)動(dòng)組大鼠血壓較運(yùn)動(dòng)5周時(shí)顯著降低，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓的作用受運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，降壓效果越好，因此高血壓患者應(yīng)堅(jiān)持長(zhǎng)期適宜的運(yùn)動(dòng)。

HSP90在心血管疾病中的作用主要通過(guò)與eNOS結(jié)合影響NO的合成，并調(diào)節(jié)NO與O2-之間的平衡，維持血管內(nèi)皮的正常功能[6]。研究證實(shí)[7]，運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)HSP90表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90的影響發(fā)現(xiàn)，SHR運(yùn)動(dòng)組大鼠與SHR對(duì)照組相比，HSP90表達(dá)顯著升高，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)可以使SHR大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90的表達(dá)增加。HSP90不僅具有“分子伴侶”，提高細(xì)胞的應(yīng)激能力，抗細(xì)胞凋亡，抗氧化的作用，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和調(diào)控信息傳遞通路作用[8]，促進(jìn)eNOS合成分泌NO。HSP90對(duì)血管內(nèi)皮功能影響的可能機(jī)制有HSP90與 eNOS的耦聯(lián)途徑[9]，PI3K/Akt信號(hào)途徑[10]，Ras/Raf/MEK/ERK 信號(hào)途徑[11，12]及 c-Src信號(hào)途徑[13]。

綜上，長(zhǎng)期適宜有氧運(yùn)動(dòng)可明顯促進(jìn)SHR大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HSP90表達(dá)，降低血壓。

[1]Moleda L，Jurzik L，F(xiàn)roh M，et al. Role of HSP-90 for increased nNOS-mediated vasodilation in mesenteric arteries in portal hypertension. World J Gastroenterol，2010，16（15）：1837-44.

[2]Michel T，Vanhoutte PM. Cellular signaling and NO production. Pflugers Arch，2010，459（6）：807-16.

[3]Harris MB，Ju H，Venema VJ，et al. Role of heat shock protein 90 in bradykinin-stimulated endothelial nitric oxide release. Gen Pharmacol，2000，35（3）：165-70.

[4]Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbillical veins identification by morphologic and immunologic criteria.Clin Invest, 1973, 53（11）：2745-2756.

[5]Petrella RJ. How effective is exercise training for the treatment of hypertension. Clin J Sport Med，1998，8：224-231.

[6]Pritchard KA Jr，Ackerman AW，Gross ER，et al. Heat shock protein 90 mediates the balance of nitric oxide and superoxide anion from endothelial nitric-oxide synthase.Biol Chem，2001，276（21）：17621-17624.

[7]Shastry S，Toft DO，Joyner MJ.HSP70 and HSP90 expression in leucocytes after exercise in moderately trained humans. Acta Physiol Scand，2002，175（2）：139-46.

[8]俞峻，馬康濤，張衡. 分子伴侶的多重功能. 生物學(xué)與生物物理進(jìn)展，1998，25（1）：106-110.

[9]Harris MB，Mitchell BM，Sood SG，et al. Increasednitric oxide synthase activity and Hsp90 association in skeletal muscle following chronic exercise. Eur J Appl Physiol，2008，104（5）：795-802.

[10]趙曉輝，彭毅志，王元元. 缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中HSP90對(duì)AKT表達(dá)的調(diào)控. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，7（4）：521-524.

[11]丁桂霞，張愛(ài)華，陳榮華. Ras/Raf/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路在腎臟疾病中作用的研究進(jìn)展. 國(guó)外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)，2000，27（5）：231：233.

[12]Zhai B，Yang H，Mancini A，Leukotriene B（4） BLT receptor signaling regulates the level and stability of cyclooxygenase-2（COX-2） mRNA through restricted activation of Ras/Raf/ERK/p42 AUF1 pathway. J Biol Chem，2010，285（31）：23568-80.

[13]Callera GE，Montezano AC，Yogi A，et al. c-Srcdependent nongenomic signaling responses to aldosterone are increased in vascular myocytes from spontaneously hypertensive rats. Hypertension，2005，46（4）：1032-8.