郝 旭 周 橋 李 聰 盧 穎 仲 芳 郭山脈 王偉銘 陳 楠

原人參二醇(protopanaxadiol，PPD)是從三七總皂苷中提取的高度純化的有效活性成分，也是人參二醇組皂苷的皂苷元。PPD有20(S)和20(R)兩種構(gòu)型，其中20(S)的活性大于20(R)，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)20(S)－PPD具有良好的抗癌活性，對多種癌癥細(xì)胞均有明顯抑制作用，并具有抑制腫瘤血管生成、抑制骨髓瘤細(xì)胞生長等活性。

眾多研究表明，以20(S)－PPD為皂苷元的三七總皂苷對單側(cè)輸尿管梗阻腎臟纖維化模型及糖尿病大鼠模型均有顯著的腎臟保護(hù)作用，可延緩腎臟纖維化［1，2］，體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［3］，這些均表明其可延緩腎臟疾病進(jìn)程。但是作為三七總皂苷有效活性成分之一，20(S)－PPD在腎臟疾病過程中的作用研究尚少。

阿霉素腎病模型能夠較好模擬人類慢性腎臟病，在腎臟病的研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。急性模型類似于人類微小病變性腎小球腎炎，慢性模型類似于人類局灶節(jié)段性腎小球硬化，主要表現(xiàn)為腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。本研究利用阿霉素建立慢性腎病模型，旨在初步觀察20(S)－PPD在阿霉素腎病大鼠中的腎臟保護(hù)作用。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級SD雄性大鼠30只，體重180～200g，購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件:室溫20℃ ～25℃，相對濕度55% ～60%，每2只裝一個(gè)大鼠籠，每日正常日光照射，保持房間通風(fēng)、恒溫、安靜，自由飲水?dāng)z食，每日更換墊料。

藥物及試劑 鹽酸阿霉素購自上海生工，20(S)－PPD粉劑由上海中藥創(chuàng)新研究中心提供，纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ型膠原(COL I)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)兔抗大鼠一抗購自Sigma公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新公司。

動(dòng)物模型制備與分組 30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為三組:正常對照組、阿霉素模型組、20(S)－PPD干預(yù)組，每組10只。阿霉素腎病模型建立中阿霉素用量依據(jù)Okasora等［4］的研究，為降低模型死亡率，本研究采用分次注射。因大鼠尾靜脈較細(xì)，為防止將藥液注射至血管外而引起尾部損傷，本研究選取較粗的陰莖靜脈進(jìn)行藥物注射。阿霉素組、20(S)－PPD干預(yù)組注射鹽酸阿霉素首量5 mg/kg，并于注射的第8天追加2.5 mg/kg，使總累積劑量達(dá)7.5 mg/kg，對照組注射等量生理鹽水。20(S)－PPD干預(yù)組于第二次注射阿霉素后給予20(S)－PPD 200 mg/(kg·d)灌胃 8 周。

標(biāo)本收集 阿霉素腎病模型建立前于清潔代謝籠收集大鼠尿液，－80℃保存;20(S)－PPD灌胃8周后處死大鼠，心臟穿刺取血，離心分離血清，－80℃保存;留取大鼠腎臟組織適量置于10%甲醛固定，用于常規(guī)病理染色及免疫組化檢查。

檢測指標(biāo)

生化指標(biāo) 收集大鼠血標(biāo)本測定白蛋白、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、三酰甘油及膽固醇，尿標(biāo)本測定尿白蛋白、尿肌酐、肌酐白蛋白/肌酐比等。

病理形態(tài)學(xué)檢查 留取的腎臟組織標(biāo)本依次經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片厚2 μm，行常規(guī)HE染色及Masson染色，觀察各組大鼠的腎小球及腎小管間質(zhì)的組織學(xué)改變情況。Masson染色利用Image－Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行腎小管間質(zhì)纖維化程度的半定量分析。

電鏡檢查 留取的腎臟組織電鏡標(biāo)本依次經(jīng)過固定、脫水、置換、浸透及包埋，制備成電鏡切片，利用PHILIP CM－80透射電鏡觀察大鼠腎小球足細(xì)胞的病變情況。

免疫組織化學(xué)檢查 采用SP法利用免疫組化試劑盒進(jìn)行檢測。3%H2O2室溫孵育30 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，內(nèi)源性卵白素－生物素封閉各15 min，血清封閉15 min以阻斷非特異性結(jié)合。滴加適當(dāng)濃度的一抗孵育，4℃過夜(FN 1∶200、COLⅠ 1∶100、α－SMA 1∶400);滴加二抗，室溫孵育 30 min，DAB顯色并根據(jù)鏡下反應(yīng)程度雙蒸水適時(shí)終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染、透明、封片。陰性對照組以PBS代替一抗。陽性表達(dá)者可見腎小管間質(zhì)有棕黃色纖維狀物質(zhì)沉積。每張切片在200倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)非重疊、非髓質(zhì)視野，以Image－Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對腎組織免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。為減少不同批次之間的偏差，拍照過程中統(tǒng)一所有參數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

20 (S)－PPD對阿霉素腎病大鼠生化指標(biāo)的影響 阿霉素組血白蛋白、三酰甘油及膽固醇均顯著高于正常對照組(P＜0.01)，BUN較正常對照組也明顯升高(P＜0.05)，而SCr較正常對照組無顯著性差異;20(S)－PPD組血白蛋白顯著高于阿霉素組(P＜0.05)，三酰甘油和膽固醇均顯著低于阿霉素組(P＜0.05)，SCr較正常對照組和阿霉素組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

與正常對照組相比，阿霉素組尿白蛋白、白蛋白/肌酐比顯著性升高(P＜0.01)，尿肌酐也較正常對照組升高(P＜0.05);20(S)－PPD組其尿白蛋白、肌酐及尿白蛋白/肌酐比較阿霉素組顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表1 各組大鼠的血生化結(jié)果(n=10)

表2 各組大鼠尿生化結(jié)果(n=10)

20 (S)－PPD對阿霉素腎病大鼠腎臟組織學(xué)改變的影響 HE染色顯示，對照組大鼠腎小球無硬化，腎小球毛細(xì)血管袢結(jié)構(gòu)正常，開放良好。腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，管腔未見擴(kuò)張，間質(zhì)無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。阿霉素組可見腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管袢閉鎖、皺縮，部分小球可見袢與球囊壁黏連及局灶節(jié)段性硬化樣改變。病變腎小球周圍近曲腎小管可見上皮細(xì)胞空泡變性，管腔擴(kuò)張，部分管腔內(nèi)可見蛋白管型，腎小管間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤。20(S)－PPD組可見部分腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，腎小球毛細(xì)血管袢基膜輕度增厚。腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤較阿霉素組明顯減少，小管上皮細(xì)胞排列規(guī)整，小管結(jié)構(gòu)基本正常，管腔內(nèi)管型少見。

Masson染色正常對照組僅有少量膠原分布于腎小球及腎小管基膜，間質(zhì)未見明顯膠原沉積。阿霉素組可見腎間質(zhì)明顯增寬，大量膠原蛋白沉積，纖維化明顯。20(S)－PPD組纖維化程度較阿霉素組明顯減輕，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1，2)。

圖1 20(S)原人參二醇作用下阿霉素腎病大鼠的腎臟病理改變(Masson，×400)

圖2 20(S)-PPD對阿霉素腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化半定量分析的影響

20 (S)－PPD對阿霉素腎病大鼠腎小球足細(xì)胞的影響 電鏡結(jié)果顯示，對照組腎小球足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)正常，呈齒梳狀，排列整齊，足突寬度為0.2～0.4 μm，未見明顯足突融合;阿霉素組可見腎小球足細(xì)胞足突廣泛彌漫性融合，節(jié)段腎小球足細(xì)胞脫落及裸露的基膜，未見結(jié)構(gòu)正常的足突結(jié)構(gòu);20(S)－PPD組腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，節(jié)段腎小球足細(xì)胞足突的輕度融合，足突寬度達(dá)1～2 μm(圖3)。

20 (S)－PPD對阿霉素腎病大鼠腎組織內(nèi)α－SMA、COL I及 FN 表達(dá)的影響 α－SMA、COL I及FN三者均為腎臟纖維化指標(biāo)，正常情況下在腎臟有少量分布，而在阿霉素組大量分布于腎小管間質(zhì)(圖 4－6)。Image－Pro Plus 6.0 軟件半定量分析示，對照組α－SMA、COL I、FN 有基礎(chǔ)表達(dá)，在阿霉素組三者表達(dá)量顯著高于正常對照組(P＜0.01)，而20(S)－PPD組較阿霉素組三者表達(dá)均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 各組大鼠腎小球足細(xì)胞變化(EM，×7400)

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA的表達(dá)及半定量(IHC，×200)

討 論

圖5 各組大鼠腎組織I型膠原的表達(dá)及半定量(IHC，×200)

圖6 各組大鼠FN的表達(dá)及半定量(IHC，×200)

20 (S)－PPD是人參二醇組皂苷的皂苷元，對多種腫瘤如肝癌H22、Lewis肺癌及黑色素B16細(xì)胞株的生長均具有明顯抑制作用［5］;可能通過抑制腫瘤新生血管形成，減少腫瘤血液供應(yīng)，使其增生活性下降，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長［6］。此外，以20(S)－PPD為皂苷元的原人參二醇組皂苷(panaxadiol saponins，PDS)具有顯著的腎臟保護(hù)作用。已有研究表明適量的PDS可促進(jìn)正常培養(yǎng)和急性缺血－再灌注腎損傷性兔血清處理后的人腎小管細(xì)胞增生［7］。韓國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PDS可下調(diào)高糖誘導(dǎo)大鼠的腎小球系膜細(xì)胞FN表達(dá)。但對于20(S)－PPD在腎臟方面的作用研究較少。

本研究利用20(S)－PPD干預(yù)阿霉素腎病模型，觀察其腎臟保護(hù)作用并初步探討其作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)于阿霉素注射后8周，阿霉素組大鼠出現(xiàn)明顯的蛋白尿，尿白蛋白/肌酐比較正常對照組顯著升高，血白蛋白明顯下降，而血脂升高顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈明顯的腎病綜合征的表現(xiàn)。腎臟常規(guī)病理顯示阿霉素組，腎小球及腎小管間質(zhì)損傷嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為腎小球的局灶節(jié)段性硬化及間質(zhì)纖維化，而20(S)－PPD組腎小球及間質(zhì)損傷較阿霉素組明顯減輕?？梢?0(S)－PPD對阿霉素腎病大鼠在生化指標(biāo)及腎臟病理均具有明顯的保護(hù)作用。各組大鼠腎小球足細(xì)胞電鏡結(jié)果顯示阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞損傷嚴(yán)重，部分可見足細(xì)胞的脫落及裸露基膜，而20(S)－PPD組腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。因此，20(S)－PPD對阿霉素腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用可能是通過其保護(hù)腎小球足細(xì)胞損傷，減少蛋白尿，改善腎功能而發(fā)揮作用的。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)聚集是腎臟纖維化的主要病理特征［8］。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF－β1)在腎小球及腎小管間質(zhì)纖維化形成過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［9］，通過自分泌和旁分泌方式作用于單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子及ECM的表達(dá)和分泌并減少ECM的降解，從而促進(jìn)腎臟纖維化［10］。眾所周知，肌成纖維細(xì)胞的形成、增生是腎小管間質(zhì)纖維化的重要病理生理過程。多種疾病的刺激使TGF－β1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞－ECM間連接蛋白的表達(dá)，細(xì)胞極性消失，并發(fā)生表型 轉(zhuǎn) 化，即 上 皮－間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 分 化 (epithelialmesenchymaltransition，EMT)，該過程的主要標(biāo)志性蛋白為α－SMA［11］。目前普遍認(rèn)為腎臟纖維化的程度與間質(zhì) α－SMA的表達(dá)水平呈正相關(guān)。FN和COL I在間質(zhì)聚集，是ECM代謝失衡時(shí)促使腎臟纖維化的重要因素之一。功能研究表明，F(xiàn)N及其受體在介導(dǎo)細(xì)胞間黏附、遷移、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用［12］。在腎臟纖維化過程中，腎小管上皮細(xì)胞通過整合素跨膜受體與FN結(jié)合，引起細(xì)胞膜功能的改變，進(jìn)而推進(jìn) EMT進(jìn)程［13］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)20(S)－PPD衍生物通過絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPK)途徑抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞fibronectin的表達(dá)［14］。在膠原成分中，COL I的表達(dá)是由 TGF－β1下游smad3、smad4分子與COL IA1/2相互作用引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)控的［15］。此外其在維持腎小球的正常形態(tài)及功能上也發(fā)揮了重要作用。本研究免疫組化結(jié)果顯示，阿霉素組大鼠腎組織間質(zhì) α－SMA、FN及COL I的表達(dá)顯著高于對照組，而20(S)－PPD組間質(zhì)α－SMA、FN和COL I的表達(dá)顯著低于阿霉素組。上述結(jié)果表明20(S)－PPD可以通過減少ECM的聚集而緩解間質(zhì)纖維化的發(fā)展，進(jìn)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，20(S)－PPD對阿霉素腎病大鼠模型有顯著的腎臟保護(hù)作用，可能與其保護(hù)腎小球足細(xì)胞損傷，減少蛋白尿，進(jìn)而延緩腎小管間質(zhì)損傷密切相關(guān)。而其抗間質(zhì)纖維化的具體分子機(jī)制尚需及進(jìn)一步研究。

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