文吉秋 陳勁松 季曙明 陳惠萍 孫啟全 程?hào)|瑞 劉志紅

腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)仍然是影響移植腎預(yù)后的一個(gè)重要因素。Sarwal等［1］首次提出腎移植急性排斥反應(yīng)組織中CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)是判斷移植腎急性排斥反應(yīng)預(yù)后不良的重要因素。隨后很多研究證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)［2－4］，近期研究發(fā)現(xiàn)CD38+B淋巴細(xì)胞聯(lián)合CD20+細(xì)胞是移植腎預(yù)后較差的指標(biāo)［5］，抗CD20單克隆抗體可以有效治療移植腎難治性排斥反應(yīng)，并取得了較好效果［6，7］。然而也有學(xué)者認(rèn)為移植腎急性排斥反應(yīng)中CD20淋巴細(xì)胞聚集與移植腎預(yù)后無(wú)相關(guān)性［8－10］。迄今為止，CD20淋巴細(xì)胞聚集與移植腎預(yù)后的關(guān)系還存在爭(zhēng)議。

既往研究顯示，移植腎急性排斥反應(yīng)中CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)是預(yù)后不良的標(biāo)志，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD20+細(xì)胞聚集較多的患者急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間晚于CD20+細(xì)胞聚集較少者［11］，這與此后的研究結(jié)論相一致［12］。本研究回顧性分析了不同時(shí)期急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)中各種不同類型浸潤(rùn)細(xì)胞的分布特點(diǎn)，特別關(guān)注在不同時(shí)期發(fā)生的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)中CD20+細(xì)胞聚集與移植腎預(yù)后之間的關(guān)系。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象 2003年5月～2008年12月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所行同種異體腎移植并經(jīng)移植腎活檢診斷急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)患者55例(符合Banff 97標(biāo)準(zhǔn)IA，IB和ⅡA級(jí))，腎組織C4d免疫熒光染色均為陰性［13］。入選患者根據(jù)排斥反應(yīng)和腎活檢時(shí)間分為3組［14］:極早期排斥反應(yīng)組17例(極早期組，＜2周)，早期排斥反應(yīng)組16例(早期組，2周～6月)和晚期排斥反應(yīng)組22例(晚期組，＞6月)。

治療和隨訪 患者均接受抗CD25單克隆抗體誘導(dǎo)治療(賽尼哌或舒萊)，維持性免疫抑制劑方案包括神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(他克莫司或者環(huán)孢素)，抗增生藥物(霉酚酸酯或咪唑立賓)和潑尼松。在診斷為急性細(xì)胞排斥反應(yīng)后均接受積極的免疫抑制治療，首先予甲潑尼龍500mg沖擊治療3d，之后潑尼松逐漸減至維持劑量。甲潑尼龍沖擊治療后3d內(nèi)血清肌酐(SCr)無(wú)下降者定義為激素耐藥［2］，加用免疫吸附等強(qiáng)化治療?；颊唠S訪中位期為48月。

腎活檢 移植腎活檢在B超引導(dǎo)下實(shí)行實(shí)時(shí)穿刺，穿刺針為18G，采用負(fù)壓吸引穿刺法，取得腎組織符合Banff規(guī)定的要求［13］。

光鏡 用石蠟切片行HE、PAS和PASM染色，并在尼康8100顯微鏡下觀察。其中腎小球炎、間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)、動(dòng)脈內(nèi)膜炎、腎小管炎采等反應(yīng)急性排斥反應(yīng)的指標(biāo)采用Banff 97方法進(jìn)行積分。

免疫熒光 應(yīng)用冰凍組織切片行 IgA，IgG，IgM，C3，C4和 C4d染色。

免疫組織化學(xué) 應(yīng)用石蠟切片免疫組織化學(xué)Envision兩步法:石蠟切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，用1 ml EDTA溶液經(jīng)高壓鍋修復(fù)抗原，用正常10%小牛血清封閉，經(jīng)洗滌后分別加入單克隆鼠抗人CD20抗體(1∶100)和HLA-DR 抗體(1∶50)，CD68(1∶100)，CD4(1∶100)，CD8(1∶100)室溫孵育2h后，再加入Envision室溫孵育40 min，DAB 顯色5 min，蘇木素復(fù)染2 mins，烘干，中性樹(shù)膠封片。尼康8100顯微鏡下觀察［15］。HLA-DR判斷標(biāo)準(zhǔn)是計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)小管的百分比，用百分?jǐn)?shù)來(lái)表示［15］。

細(xì)胞密度計(jì)算方法 由不知情臨床資料的病理醫(yī)生讀片，隨機(jī)選取16個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，總和為細(xì)胞密度(個(gè)/mm2)。根據(jù)細(xì)胞密度的中位數(shù)來(lái)判定高密度和低密度組。

觀察內(nèi)容 首先比較各組之間臨床資料和CD20+，CD4，CD8，CD68 細(xì)胞密度以及 HLA-DR 表達(dá)的差別，以及不同時(shí)期排斥反應(yīng)臨床特征和各種細(xì)胞密度分布特點(diǎn)。然后對(duì)所有入選患者根據(jù)CD20+細(xì)胞密度分為高密度組和低密度組，比較兩組之間CD68，CD4，CD8細(xì)胞密度以及HLA-DR表達(dá)的差別和移植腎存活率有無(wú)差別。再對(duì)兩周后發(fā)生的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)受者根據(jù)CD20+細(xì)胞密度分為高密度組和低密度組，比較兩組之間的移植腎存活率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組之間率的差別應(yīng)用Fisher’s精確概率計(jì)算，兩組間一致性比較應(yīng)用方差分析。生存分析運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析法和Log-Rank方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況 三組患者性別比、供者類型，術(shù)前群體反應(yīng)性抗體水平、SCr、冷熱缺血時(shí)間和Banff病理分級(jí)之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，但極早期組耐激素比例和移植腎丟失率均低于早期和晚期組。

表1 不同時(shí)期急性排斥反應(yīng)患者的臨床特征

不同時(shí)期急性排斥反應(yīng)組織浸潤(rùn)細(xì)胞的差別極早期CD20+細(xì)胞密度低于早期組和晚期組，而CD4，CD8，CD68密度和腎小管 HLA-DR表達(dá)在三組之間無(wú)明顯差別。進(jìn)一步計(jì)算發(fā)現(xiàn)，極早期組(CD4+CD8)/CD20比值明顯高于早期和晚期排斥反應(yīng)組(表2)。

表2 不同時(shí)間急性排斥反應(yīng)組浸潤(rùn)細(xì)胞和小管HLA-DR表達(dá)的差別

CD20+細(xì)胞密度與移植腎預(yù)后的關(guān)系 所有入選患者按CD20+細(xì)胞密度中位數(shù)(168個(gè)/mm2)分為高密度組和低密度組。高密度組激素耐藥的比例高于低密度組(12/28 vs 4/27，P＜0.05)，Kaplan-Meier生存分析法顯示，CD20+細(xì)胞高密度組生存率低于低密度組(P＜0.05)(圖1)。

為排除其他因素對(duì)預(yù)后判斷的影響，對(duì)比CD20+細(xì)胞高密度組和低密度組的其他病理特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，腎小球炎、間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)和動(dòng)脈內(nèi)膜炎無(wú)明顯差別，其他浸潤(rùn)細(xì)胞(CD4、CD8、CD68)和腎小管HLA-DR表達(dá)亦無(wú)明顯差別(表3)。CD20+細(xì)胞高密度組腎小管炎程度高于低密度組(P＜0.05)，而腎小管炎發(fā)生率無(wú)明顯差別(均為100%)。進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在CD20+細(xì)胞低密度組兩周內(nèi)急性排斥反應(yīng)比例明顯偏高(14/27 vs 2/18 P＜0.05)。

圖1 CD20+細(xì)胞高密度組和低密度組生存率分析

表3 CD20+細(xì)胞低密度組和高密度組病理特點(diǎn)

2周以后急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)組CD20+細(xì)胞密度與移植腎預(yù)后的關(guān)系 考慮到極早期急性排斥反應(yīng)預(yù)后好(表1)，而在此期內(nèi)發(fā)生的急性排斥反應(yīng)CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)較少(表2)。為避免排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間干擾CD20+細(xì)胞密度與移植腎生存率的關(guān)系，對(duì)腎移植術(shù)兩周后發(fā)生急性排斥的患者，依據(jù)該組CD20+細(xì)胞密度的中位數(shù)(≥224/mm2)分為CD20+細(xì)胞高密度組和低密度組，兩組之間耐激素比例無(wú)差別(8/19 vs6/19，P＞0.05)，移植腎生存率也無(wú)明顯差別(P＞0.05)(圖2)。

圖2 兩周后發(fā)生的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)不同CD20+細(xì)胞組移植腎生存率

討 論

CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)和排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間的關(guān)系我們既往研究證實(shí)CD20+細(xì)胞聚集是移植腎預(yù)后不良的指標(biāo)［11］，與 Sarwal最初的結(jié)論一致［1］，但又不同于后續(xù)有關(guān) CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)和預(yù)后的報(bào)道［8－10］。這些研究結(jié)果之所以存在差別，筆者認(rèn)為主要與CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)、入選病例排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間及隨訪時(shí)間等因素有關(guān)，這些因素的變異導(dǎo)致了結(jié)果的不確定性。本研究觀察了CD20+細(xì)胞在不同時(shí)期細(xì)胞性排斥反應(yīng)中的分布特點(diǎn)，并進(jìn)一步證實(shí)在移植腎急性排斥反應(yīng)中CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)和預(yù)后的關(guān)系。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CD20+細(xì)胞高密度組急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間較晚［(145.4±121.2)d vs(75.4 ±108.8)d，P ＞0.05］［11］，提示 CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)可能與移植腎急性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間有關(guān)，在移植后兩周內(nèi)發(fā)生急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)者少有CD20+細(xì)胞聚集，而以其他單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為主(如CD4、CD8和CD68等)(表2)。但兩周后發(fā)生的急性排斥反應(yīng)中，部分患者已有CD20+細(xì)胞聚集，在超過(guò)6月的排斥反應(yīng)中，CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)聚集發(fā)生率更高。而CD4、CD8和CD68細(xì)胞浸潤(rùn)程度和排斥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間無(wú)此規(guī)律。

CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)和移植腎預(yù)后的關(guān)系 在Sarwal最初的研究中采用定量法來(lái)計(jì)算CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)密度［1］，分為高密度組(＞250個(gè)/mm2)和低密度組(＜100個(gè)/mm2)。本研究是參照Sarwal最初提出的定量計(jì)算法來(lái)計(jì)算CD20+細(xì)胞密度，與之不同的是將所有患者根據(jù)CD20+細(xì)胞密度中位數(shù)分為高密度和低密度組。因此相對(duì)于所有急性排斥反應(yīng)患者，CD20+細(xì)胞密度中位數(shù)為168個(gè)/mm2。而腎移植術(shù)后兩周以后的急性排斥患者，CD20+細(xì)胞密度的中位數(shù)為224個(gè)/mm2。此舉的目的是為了對(duì)比不同時(shí)期細(xì)胞密度的差別。我們采用的定量法與其他學(xué)者提出的半定量計(jì)數(shù)法也具有良好的一致性［13］。因此我們認(rèn)為此法具有科學(xué)性和可重復(fù)性，尤其是病理醫(yī)生對(duì)于臨床資料的雙盲更加保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

根據(jù)CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)密度中位數(shù)將入選患者分為高密度組和低密度組結(jié)果顯示，兩組間近期和遠(yuǎn)期預(yù)后均較差，其中高密度組耐激素的比例高于低密度組，高密度組生存率低于低密度組這個(gè)結(jié)論與以前的某些研究結(jié)果相一致［2－4］。而對(duì)兩周后發(fā)生的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CD20+細(xì)胞高密度組和低密度組之間耐激素比例和移植腎生存率也無(wú)明顯差別，這個(gè)結(jié)論與既往某些研究有存在一致性［9，10］。

之所以出現(xiàn)上述不同結(jié)果，其可能原因在于極早期急性排斥組預(yù)后相對(duì)較好，而兩周后發(fā)生的排斥反應(yīng)近期和遠(yuǎn)期預(yù)后均相對(duì)較差(表1)，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致［15－18］。而本研究發(fā)現(xiàn)在極早期發(fā)生的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)中很少有CD20+細(xì)胞，因此極早期排斥反應(yīng)受者大部分為CD20+細(xì)胞低密度組。對(duì)所有排斥反應(yīng)進(jìn)行分析時(shí)，低密度患者中納入了大部分極早期患者，而這部分患者預(yù)后較好導(dǎo)致低密度組預(yù)后較好。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)高密度組和低密度組之間 CD4，CD8，CD68細(xì)胞密度，HLADR表達(dá)，細(xì)胞浸潤(rùn)程度，腎小球炎及動(dòng)脈內(nèi)膜炎均無(wú)差別，但是腎小管炎在CD20+細(xì)胞高密度組較為明顯，但是發(fā)生率無(wú)明顯差別(表3)。由以上資料得出，單純CD20+細(xì)胞密度不是判斷移植腎預(yù)后的指標(biāo)，而是與發(fā)生排斥反應(yīng)的時(shí)間有很大聯(lián)系，這也恰好解釋了先前不同研究結(jié)論之間的差異。

其他表型B淋巴細(xì)胞和急性排斥反應(yīng)預(yù)后之間的關(guān)系 CD20+細(xì)胞在移植腎中浸潤(rùn)與抗體產(chǎn)生無(wú)關(guān)［15］。Zarkhin等［12］研究認(rèn)為 CD20+細(xì)胞在移植腎排斥反應(yīng)中可能參與抗原遞呈作用，與抗體產(chǎn)生無(wú)關(guān)，而 CD20+細(xì)胞進(jìn)一步分化為 CD38+和CD138+陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞可能與抗體產(chǎn)生有關(guān)，但是此結(jié)論需要進(jìn)一步證實(shí)，極早期發(fā)生的急性排斥反應(yīng)無(wú)需CD20+細(xì)胞參與，在兩周后發(fā)生急性排斥中CD20+細(xì)胞參與抗原遞呈，而晚期CD20+細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD38+和CD138+陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞，參與體液性排斥反應(yīng)，該假說(shuō)需要進(jìn)一步證實(shí)。

但是，目前的研究結(jié)論認(rèn)為CD20+細(xì)胞在移植腎中浸潤(rùn)與抗體產(chǎn)生無(wú)關(guān)是基于現(xiàn)有經(jīng)典的體液性排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，而新近的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典體液性排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)存在敏感性低而特異性高的缺點(diǎn)，認(rèn)為C4d在管周毛細(xì)血管的沉積診斷體液性排斥反應(yīng)可能是敏感性低而特異性高，可能會(huì)漏診某些病例，并提出了診斷體液性排斥反應(yīng)的新標(biāo)準(zhǔn)［19，20］，但尚未得到認(rèn)同，需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

小結(jié):在兩周內(nèi)發(fā)生的急性排斥反應(yīng)中有多種單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，但少有CD20+細(xì)胞聚集，兩周后發(fā)生的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)中，CD20+細(xì)胞浸潤(rùn)程度與預(yù)后無(wú)關(guān)。而整體急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)中，CD20+細(xì)胞低密度組的患者預(yù)后較好，可能與低密度組中極早期排斥反應(yīng)比例較高有關(guān)。

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