謝永紅,王耀玲,程小麗,張 瑋,王紅理,方湘怡*

1.西安交通大學(xué)理學(xué)院實(shí)驗(yàn)物理中心,西安 710049;2.西安市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710049;3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,血液學(xué)研究中心,西安 710049

SPR技術(shù)是一種新興的生化檢測技術(shù)。自從上世紀(jì) 80年代 Nylander和 Liedberg等將其引入到氣體檢測和生物傳感器領(lǐng)域中[1-3]以來,經(jīng)過 20多年的發(fā)展,SPR傳感技術(shù)由于其靈敏度高、反應(yīng)快速、可重復(fù)性好、樣品無需標(biāo)記、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4],已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、藥品篩選等領(lǐng)域[5-7]。

白血病是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性腫瘤,在我國已被列為十大高發(fā)性惡性腫瘤之一。我國白血病的發(fā)病率約為 3/10萬 ～4/10萬人口[8],其中急性白血病發(fā)病急、發(fā)展快、死亡率高。因此,及早地診斷白血病具有非常重大的意義。CD33是一種急性白血病髓系抗原。有關(guān)白血病免疫分型的研究資料表明：90%急性髓系白血病(AML)患者的髓系腫瘤細(xì)胞表面都表達(dá) CD33抗原,而這種抗原在正常造血干細(xì)胞及非造血細(xì)胞表面不表達(dá),這些發(fā)現(xiàn)說明 CD33抗原可能是 AML特異性診斷和治療的最佳靶抗原[9-10]。目前,對于 CD33抗原的檢測應(yīng)用最廣泛的方法是流式細(xì)胞術(shù)(FCM),但是這種方法需要特殊儀器,操作技術(shù)要求高,價(jià)格昂貴,結(jié)果的重復(fù)性欠佳。

本實(shí)驗(yàn)采用自組裝單層膜技術(shù),在傳感芯片表面修飾抗 CD33單克隆抗體,首次運(yùn)用自行構(gòu)建的Kretschmann結(jié)構(gòu)波長調(diào)制型 SPR生物傳感器檢測AML患者骨髓血液和健康人骨髓血液中 CD33抗原的表達(dá),并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果和 FCM結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示 SPR生物傳感器能夠很好的檢測出人骨髓液中 CD33抗原的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還在相同的條件下,用該 SPR生物傳感器檢測了分離的骨髓血液和骨髓全血,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SPR生物傳感器對 CD33抗原的特異選擇性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

自行構(gòu)建的 Kretschmann結(jié)構(gòu)波長調(diào)制型 SPR生物傳感器、KQ-100KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、KYKY SBC-12型真空離子濺射儀(北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)、抗 CD33單克隆抗體(Beckman Coulter Inc)、人骨髓血液樣品(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床采集)、TBST溶液(由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病醫(yī)院生物學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供)、MPA和 NHS(均購于美國,Alfa Aesar)、EDC(購于上海 Medpep有限公司)、牛血清蛋白(BSA)、丙酮、無水乙醇、丙三醇等。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純,所用水均為二次去離子水,所用緩沖液為磷酸鹽溶液(PBS,pH 7.4)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SPR生物傳感器的原理

本實(shí)驗(yàn)用的 SPR生物傳感器基于Kretschmann-Raether衰減全反射配置[11],采用固定入射角,在一定波長范圍(400 nm～740 nm)內(nèi)對共振波長進(jìn)行測量。其檢測方法是通過待測物和修飾在傳感芯片表面的生物分子反應(yīng),引起與芯片金膜接觸的介質(zhì)的介電常數(shù)的變化,從而引起共振波長的改變來反映分析物的生物反應(yīng)過程和性質(zhì)[12]。

1.2.2 傳感片的制作

本文選用穩(wěn)定性好的金膜作為傳感膜,折射率與棱鏡相匹配的玻璃片作為基片。將基片分別用去離子水、丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗 10 min,然后用氮?dú)獯蹈?。再將處理好的基片放?KYKY SBC-12型真空離子濺射儀的真空腔襯底座上,先鍍一層鉻(厚度約為 2 nm)以增強(qiáng)金原子的粘附力,使金膜不容易脫落,再鍍一層金膜(厚度為 50 nm)。

1.2.3 CD33單克隆抗體的固定

將傳感片浸入 0.1%(m/m)MPA的無水乙醇溶液中,于室溫下放置 12 h,取出后依次用無水乙醇和二次去離子水清洗以除去沒有吸附的 MPA;再將0.4mol/L的 EDC溶液和 0.1 mol/L的 NHS溶液按1∶1(V/V)的比例混合,滴于傳感片的金膜上,于35℃下放置1 h后用二次去離子水洗去未鍵合的混合溶液;然后在已活化的金膜上滴上抗 CD33單克隆抗體溶液(該溶液已用 PBS緩沖液按 1∶300的比例稀釋)于 37℃下放置 1 h,用 PBS緩沖液洗去未吸附的CD33單克隆抗體;最后將 BSA溶液(1 mg/mL)滴于金膜上,于 35℃下放置 40min以封閉殘余的巰基,減少非特異性吸附,然后用 PBS緩沖液洗去未吸附的BSA溶液,氮?dú)獯蹈?并將已修飾好 CD33單克隆抗體的傳感片置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 用 SPR生物傳感器檢測樣品

將已經(jīng)修飾了抗 CD33單克隆抗體的傳感片用折射率相匹配的丙三醇耦合在棱鏡上,調(diào)節(jié)光路并采集黑、白對照光譜圖,在樣品池中加入 100μL PBS緩沖液,記錄光譜圖 1,然后再在樣品池中加入100μL的待測骨髓血液樣品,保持 1 h使抗體-抗原充分反應(yīng),然后用 TBST溶液沖洗傳感片,以減少非特異性吸附,然后再用 PBS緩沖液沖洗,記錄光譜圖 2,分析上述光譜圖,就可以得到抗原-抗體結(jié)合后共振波長的變化值。整個(gè) SPR實(shí)驗(yàn)都是在 25℃的溫度條件下進(jìn)行,樣品加入前后的光譜圖均在以PBS緩沖液為環(huán)境液體的條件下測得。這樣可以有效地減少其他因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

圖1 MPA自組裝(a)、抗 CD33單克隆抗體的固定(b)、陰性對照(c)、陽性對照(d)的 SPR光譜圖

1.2.5 傳感片的再生

傳感片的再生就是用一定濃度的酸、堿溶液或者離子試劑,破壞抗體-抗原之間的結(jié)合,使抗體-抗原離解。本實(shí)驗(yàn)采用 Piranha試劑(濃 H2SO4和 30%H2O2按體積比 3∶1混合,該溶液具有強(qiáng)氧化性,每次少量配置)作為洗脫液滴于傳感片金膜表面,每次反應(yīng) 3min,然后用二次去離子水清洗,并用氮?dú)獯蹈?如此重復(fù)洗3次,能有效地洗脫傳感片表面吸附的所有抗體及其免疫復(fù)合物,實(shí)現(xiàn)傳感片的再生。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗CD33單克隆抗體的固定和抗原-抗體反應(yīng)

將生物分子固定在傳感片表面的方法有很多[13]。本實(shí)驗(yàn)采用的是自組裝膜技術(shù),先在金膜表面自組裝一層巰基單分子膜,然后通過EDC和NHS混合溶液的活化作用生成 NHS活潑脂中間體,將抗 CD33單克隆抗體分子牢固地固定在金膜表面。以 AML患者骨髓血液作為陽性對照組,健康人骨髓血液作為陰性對照組,圖1顯示的是所測得的 SPR光譜圖。

比較光譜曲線 a和 b的峰值,我們可以看到共振波長明顯增大了。這是因?yàn)榻鹉け砻娓浇橘|(zhì)的折射率發(fā)生了變化,而介質(zhì)折射率的改變又與固定在金膜表面的抗體分子有關(guān)。曲線 a和 b之間的共振波長之差說明抗 CD33單克隆抗體已經(jīng)很好地固定在金膜上了。再比較曲線 b,c和 d,我們可以看到：與曲線 b的共振波長相比,曲線 c的共振波長的增長幅度明顯小于曲線 d的共振波長的增長幅度,其中 δλcb為1.601 nm,δλdb為 18.10 nm。這與抗原-抗體反應(yīng)的特異性相符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該 SPR傳感器能很好的檢測出樣品骨髓液中 CD33抗原的表達(dá)情況。

2.2 SPR生物傳感器對CD33抗原的特異選擇性

骨髓全血是從 AML患者身上采集的骨髓血液,沒有經(jīng)過分離,它除了含有表達(dá) CD33抗原的細(xì)胞之外,還含有其他蛋白質(zhì)分子以及脂類分子等,成分十分復(fù)雜,而經(jīng)過分離的骨髓血液的成分則相對簡單。本實(shí)驗(yàn)在相同條件下檢測了 AML患者骨髓全血和經(jīng)過分離的骨髓血液,以此研究 SPR生物傳感器對 CD33抗原的特異選擇性。

在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的前提下,用上述檢測方法對 AML患者骨髓全血和經(jīng)過分離的骨髓血液進(jìn)行檢測,結(jié)果如表 1所示。

表1 SPR生物傳感器對不同類型的骨髓血液的響應(yīng)值

從表 1的結(jié)果可以看出,SPR生物傳感器對上述兩種類型骨髓血液的響應(yīng)值基本一致。這表明,其他蛋白質(zhì)分子對檢測結(jié)果的干擾很小,SPR生物傳感器對 CD33抗原具有良好的特異選擇性。

2.3 SPR結(jié)果和FCM結(jié)果的比較

本實(shí)驗(yàn)用 SPR生物傳感器檢測了幾組樣品,并將結(jié)果與西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相比較。圖 2顯示的是 SPR方法與 FCM方法檢測的結(jié)果。

比較圖 2(A)和(C)中的曲線 a,b可得待樣品溶液充分反應(yīng)后共振波長的增長值分別為 16.865 nm和 1.027 nm。對照陰性實(shí)驗(yàn)組和陽性實(shí)驗(yàn)組,判斷(A)中的樣品 1為陽性,即為 AML病人骨髓液,(C)中的樣品 2為陰性,即為健康人骨髓液。比較此結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果,兩者一致。

圖2 SPR結(jié)果與 FCM結(jié)果的比較。(A)和(B),(C)和(D)分別表示樣品 1和樣品 2的SPR譜和FCM圖。其中,(A)和(C)中的曲線 a為修飾了抗 CD 33單克隆抗體的傳感芯片的 SPR譜,曲線 b為樣品的 SPR譜

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 SPR方法的可行性和準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)檢測了由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液學(xué)研究中心提供的臨床診斷為 AML病人的骨髓液和健康人的骨髓液,結(jié)果如圖 3所示。其中 No.1,3～6,8～10,12,13,15,16,18～20為 AML病人骨髓液,No.2,7,11,14,17,21,22為健康人骨髓液。

從圖 3的檢測結(jié)果來看,AML病人骨髓液的共振波長增長值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于健康人骨髓液的共振波長增長值,其中,該 SPR生物傳感器對 AML患者和健康人骨髓血液中 CD33抗原的最大響應(yīng)值分別為 20.637 nm和 3.402 nm。其結(jié)果均與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果相符。從圖 3中我們也可以看到,盡管都是 AML病人骨髓液,但是它們的共振峰移動(dòng)幅度卻不相同,究其原因,可能與白血病的高度異質(zhì)性和異源性有關(guān)。

圖3 22個(gè)樣品的SPR檢測結(jié)果柱形圖。樣品1,3～6,8～10,12,13,15,16,18～20為 AML患者的骨髓液,樣品 2,7,11,14,17,21,22為健康人骨髓液

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用 SPR生物傳感器,在傳感芯片表面固定抗 CD33單克隆抗體,以健康人骨髓血液為陰性對照組,已知屬性的 AML患者骨髓血液為陽性對照組,檢測人骨髓血液中急性白血病髓系抗原CD33的表達(dá)。結(jié)果顯示 SPR生物傳感器能很好地檢測出樣品血液中 CD33的表達(dá)差異。同時(shí),實(shí)驗(yàn)表明 SPR生物傳感器對 CD33抗原的特異選擇性好。與傳統(tǒng)的 FCM方法相比,SPR生物傳感器還具有操作簡單、樣品無需標(biāo)記、靈敏度高、能夠快速給出定量結(jié)果的優(yōu)點(diǎn),因此 SPR生物傳感器在急性白血病髓系抗原 CD33的檢測中有著廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí),該實(shí)驗(yàn)也為 SPR生物傳感器在白血病的臨床診斷中的應(yīng)用研究提供了新思路。

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