馬 駿 聶勝男 張建波 孟 凱 王明玉

腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是1個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中涉及到多種癌基因的激活和抑癌基因的失活［1］。nm23作為抑癌基因，通過(guò)影響微管聚合狀態(tài)及G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［2］。E-cadherin作為另1種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，與nm23能夠協(xié)同抑制胃癌的轉(zhuǎn)移［3］。CD44是1種細(xì)胞表面黏附分子，標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44s)主要在間質(zhì)和造血細(xì)胞中表達(dá)，為透明質(zhì)酸鹽的主要受體，CD44s及其變異體可在多種腫瘤中表達(dá)［4］。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)，檢測(cè) nm23和 E-cadherin及CD44s基因在胃癌組織中的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理因素的關(guān)系，旨在探討nm23和E-cadherin及CD44s基因在胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取泰安市中心醫(yī)院2006年07月～2010年07月手術(shù)切除、并經(jīng)病理檢查確診的50例胃癌標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未行化療或放療，并有完整的臨床病理資料。男性32例，女性18例。年齡25～72歲，平均年齡59.1歲，中位年齡61歲。根據(jù)UICC(1997年)第5版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。腫瘤細(xì)胞組織學(xué)分化:高分化癌22例，中分化癌15例，低分化癌13例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。選取30例胃癌組織標(biāo)本的相應(yīng)癌旁組織(距離癌灶≥2 cm)作為對(duì)照組，所有癌旁組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí)為癌旁正常組織。

1.2 主要試劑

鼠抗人nm23和CD44s單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，鼠抗人E-cadherin(MAB-4A2)為丹麥DAKO公司產(chǎn)品(1∶80稀釋);SP試劑盒、DAB顯色劑均為SantaCruz公司產(chǎn)品。免疫組化染色程序按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

4%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。免疫組化SP法檢測(cè)步驟:3%H2O2作用20 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性;0.01 mol/L PBS(pH=7.4)漂洗2 min×3次;10%正常羊血清37℃孵育2 h;PBS液沖洗5 min;Envision混合液室溫孵育2 h;DAB顯色。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知nm23和E-cadherin及CD44s陽(yáng)性表達(dá)的胃癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

nm23陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)為棕黃色或深棕色，陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈彌散性分布;E-cadherin和CD44s陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒狀。所有切片均采用雙盲觀察，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%，無(wú)染色或染色較弱，為陰性(－);陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%，染色較強(qiáng)，則為陽(yáng)性(+)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，數(shù)據(jù)計(jì)算應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中各基因的表達(dá)情況

胃癌組織中 CD44s陽(yáng)性表達(dá)率為44.5%(22/50)，癌旁組織中其陽(yáng)性表達(dá)率為13.3%(4/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=4.23，P ＜0.05。胃癌組織中nm23基因陽(yáng)性細(xì)胞染色為黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)和胞膜。胃癌組織中其陽(yáng)性表達(dá)率為48.0%(24/50)，癌旁組織中其陽(yáng)性表達(dá)率為63.3%(19/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=5.89，P ＜0.05。胃癌組織E-cadherin陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜，為棕黃色顆粒狀。胃癌組織中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率為52.0%(26/50)，癌旁組織為70.0%(21/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=9.45，P ＜0.05。

2.2 CD44s、E-cadherin及nm23基因陽(yáng)性表達(dá)與胃癌組織臨床病理特征的關(guān)系

nm23基因表達(dá)與腫瘤組織分化程度相關(guān)，隨著腫瘤組織分化程度的增加而增強(qiáng)，P＜0.001;Ⅰ+Ⅱ期胃癌組織中nm23陽(yáng)性表達(dá)率要高于Ⅲ+Ⅳ期組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.02;無(wú)漿膜浸潤(rùn)胃癌組織中其表達(dá)率要高于有漿膜浸潤(rùn)者，P=0.012;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其表達(dá)率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，P=0.001。CD44s陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤有無(wú)漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)，χ2值分別為 11.62、12.58 和 9.78，P均＜0.05;CD44s陽(yáng)性表達(dá)與胃癌組織分化程度無(wú)關(guān)，P＞0.05;E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)與胃癌組織分化程度、有無(wú)漿膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，P均＜0.05(表 1)。

表1 抑癌及相關(guān)基因陽(yáng)性表達(dá)與胃癌組織臨床病理特征的相關(guān)性(例，%)

2.3 CD44s與nm23表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織CD44s表達(dá)與nm23表達(dá)呈一定程度的負(fù)相關(guān)性(γ=－0.287，P＜0.05)，nm23表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)性(γ=0.928，P=0.000)。

3 討論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是1個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及一系列基因，包括轉(zhuǎn)移抑制基因和轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因。其中，nm23 和 E-cadherin 是較為明確的轉(zhuǎn)移抑制基因［4，5］。nm23基因的缺失和突變與胃癌腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并與短的生存期相關(guān)［6］。nm23的編碼產(chǎn)物為二磷酸核苷激酶(NDPK)，nm23/NDPK可介導(dǎo)GDP向GTP的轉(zhuǎn)化，而這一過(guò)程與G蛋白的活性有關(guān)。Ayabe等［7］研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1基因?qū)Ψ伟┝馨徒Y(jié)微轉(zhuǎn)移可能具有抑制作用。E-cadherin與nm23有協(xié)同作用。本研究中，nm23和E-cadherin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均低于癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。nm23和E-cadherin基因的陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌組織學(xué)分級(jí)、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等密切相關(guān)，提示其在胃癌的轉(zhuǎn)移瘤形成階段具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

CD44基因位于染色體11號(hào)短臂上(11P)，共有20個(gè)外顯子構(gòu)成。有關(guān)研究表明多種腫瘤的轉(zhuǎn)移行為均與CD44基因的異常轉(zhuǎn)錄有關(guān)，CD44v6是CD44蛋白變異體，它是分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白分子主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的特異性黏附過(guò)程［2］。有文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌組織中CD44s表達(dá)率為64% ～77%，而且與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3，4］。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織 CD44s陽(yáng)性表達(dá)率為44.5%，在有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽(yáng)性率分別為56.0%和32.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CD44s表達(dá)較高。而在有、無(wú)漿膜浸潤(rùn)組織中表達(dá)率分別為51.7%和33.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明CD44s與胃癌組織的浸潤(rùn)程度有相關(guān)性。

CD44s和nm23屬于黏附分子范疇，CD44s在腫瘤組織生物學(xué)行為上的作用，與黏附因子之一整合素的作用呈協(xié)同作用［8］。整合素是1種膜鑲嵌糖蛋白，由α和β兩個(gè)亞單位非共價(jià)形成異二聚體復(fù)合物。由于亞單位的變異使整合素形成1個(gè)龐大的家族。有的參與不同細(xì)胞之間的黏附連接(異源細(xì)胞間黏附)，有的則協(xié)助細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，其中24β1和Mac 1同時(shí)具備上述2種功能。細(xì)胞表面的整合素可處于不活化狀態(tài)，有一些活化因子可增強(qiáng)整合素與相應(yīng)配體的親和力，CD44s則屬于這種強(qiáng)化因素之一，因而，在一定程度上影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的高低。nm23與上皮黏連素和金屬蛋白酶組織抑制物的基因被視為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因［9，10］。上皮黏連素抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用主要是使腫瘤細(xì)胞彼此膠著在一起，使細(xì)胞之間黏附增加，瘤細(xì)胞不易脫落而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。有關(guān)nm23抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及CD44s和nm23在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中存在怎樣的協(xié)同或拮抗作用，有待于進(jìn)一步研究。本研究顯示，胃癌組織CD44s與nm23基因的表達(dá)呈一定程度的負(fù)相關(guān)性，nm23與E-cadherin基因表達(dá)呈正相關(guān)性。

本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織CD44s和E-cadherin及nm23基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD44s和E-cadherin及nm23表達(dá)與胃癌腫瘤組織分期、浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，檢測(cè)其表達(dá)有助于臨床預(yù)測(cè)胃癌的轉(zhuǎn)移和侵襲程度。

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