景志亮 羅愛(ài)華 姜漢國(guó) 李飛虹 趙穎海

胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)屬酪氨酸蛋白激酶類受體家族，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1～4］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IGF-1R、p-ERK、cfos和Ki-67在鼻咽癌及鼻咽黏膜上皮組織中的表達(dá)，探討IGF-1R參與調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，為鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例和標(biāo)本

30例鼻咽癌和25例鼻咽黏膜慢性炎癥標(biāo)本均取自高州市人民醫(yī)院病理科2007年1月1日～2007年12月31日存檔蠟塊。鼻咽癌患者，男性22例，女性8例，年齡28～70歲，中位年齡49歲。所有病理診斷均為非角化性癌(WHOⅡ～Ⅲ級(jí))，臨床分期均屬T1N0M0期，就診前未接受放療或化療。人低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞系為廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室保存。

1.2 試劑

兔抗人IGF-1R多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。小鼠抗人p-ERK單克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。兔抗人Ki-67單克隆抗體及SP法免疫組織化學(xué)試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。兔抗人c-fos多克隆抗體為福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

設(shè)立對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，陽(yáng)性對(duì)照用已知陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，按SP法試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè) IGF-1R、p-ERK、Ki-67 和 c-fos。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙盲法評(píng)估，綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量積分，按半定量方法判斷。按顯色深淺評(píng)分:0分，不顯色;1分，淺黃色;2分，棕黃色;3分，棕褐色。按顯色比例評(píng)分:顯色細(xì)胞數(shù)≤5%為0分;顯色細(xì)胞數(shù)6% ～25%為1分;顯色細(xì)胞數(shù)26% ～50%為2分;顯色細(xì)胞數(shù)51% ～75%為3分;顯色細(xì)胞數(shù) ＞75%為4分。以上述兩項(xiàng)乘積得分值作為判斷標(biāo)準(zhǔn):0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5分以上為(+++)。IGF-1R陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì)和胞膜，p-ERK陽(yáng)性表達(dá)大部分定位于胞核、少部分定位于胞質(zhì)，c-fos和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)定位于胞核。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 13.0做四格表 χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽組織 IGF-1R、p-ERK、c-fos和 Ki-67蛋白的表達(dá)

IGF-1R、p-ERK、c-fos和Ki-67蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 93.33%、93.33%、83.33%、86.67%，在對(duì)照組鼻咽黏膜上皮細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)率分別為 36.00%、28.00%、20.00%、4.00%，兩組間差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01，見(jiàn)表1。

2.2 鼻咽癌細(xì)胞 IGF-1R、p-ERK、c-fos和 Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)分析

30例鼻咽癌組織中IGF-1R與p-ERK、c-fos和Ki-67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(表2);p-ERK與c-fos和Ki-67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(表3);c-fos和Ki-67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(γ =0.486，P=0.006)(表 4)。

表1 鼻咽癌和鼻咽黏膜上皮細(xì)胞中IGF-1R、p-ERK、c-fos和Ki-67蛋白的表達(dá)(例，%)

表2 30例鼻咽癌組織中IGF-1R與p-ERK、c-fos、Ki-67表達(dá)的相關(guān)分析(例)

表3 30例鼻咽癌組織中p-ERK與c-fos、Ki-67表達(dá)的相關(guān)分析(例)

表4 30例鼻咽癌組織中c-fos與Ki-67表達(dá)的相關(guān)分析(例)

3 討論

IGF-1R對(duì)于正常細(xì)胞生長(zhǎng)并不是絕對(duì)需要的［5］，但在多數(shù)惡性腫瘤中則過(guò)表達(dá)。IGF-1R與其配體結(jié)合后，可以激活與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK［1～3，6］。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是 MAPK家族的重要成員，p-ERK是ERK的活化形式，轉(zhuǎn)錄因子AP-1、c-Jun和c-fos均可以被ERK磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、分化等，是1種重要的細(xì)胞增殖信號(hào)分子［7］。

c-fos是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可與同族基因產(chǎn)物c-Jun結(jié)合成異源二聚體核蛋白復(fù)合物，以高親和力結(jié)合在靶基因的DNA相關(guān)序列AP-1結(jié)合區(qū)，參與細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)功能［7］，促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。

Ki-67是細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白，是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一，Ki-67表達(dá)越多，增殖越活躍［9］。

本研究發(fā)現(xiàn):正常鼻咽黏膜上皮細(xì)胞中IGF-1R蛋白不表達(dá)或低表達(dá)，而鼻咽癌細(xì)胞中IGF-1R蛋白過(guò)表達(dá);鼻咽癌細(xì)胞中與增殖相關(guān)的信號(hào)分子p-ERK、cfos、Ki-67蛋白均呈異常激活或過(guò)表達(dá);IGF-1R、p-ERK、c-fos、Ki-67蛋白間表達(dá)呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果表明:鼻咽癌中IGF-1R蛋白過(guò)表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞增殖，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖活性增高。調(diào)控的可能機(jī)制是:鼻咽癌細(xì)胞中IGF-1R蛋白過(guò)表達(dá)，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK，活化的ERK(p-ERK)形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化激活A(yù)P-1、c-fos等核轉(zhuǎn)錄因子，引起Ki-67高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖［4，10～13］。有研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細(xì)胞的高增殖活性可能與鼻咽癌的復(fù)發(fā)和預(yù)后有關(guān)［11］，IGF-1R蛋白過(guò)表達(dá)可能與鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)［4，10］。本研究結(jié)果表明鼻咽癌中IGF-1R蛋白過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，因此，結(jié)合其它研究結(jié)果有理由認(rèn)為，IGF-1R極有可能成為鼻咽癌的治療靶點(diǎn)［2，4，10］，尤其是針對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者。

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