張景燕 王 蓉 趙靜姝 姬志娟 趙志煒 盛樹力

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

散發(fā)性老年性癡呆(sporadic Alzheimer disease，SAD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能下降和行為異常。腦內(nèi)糖代謝障礙可以引起認(rèn)知功能受損，而AD病人也常伴有腦內(nèi)糖代謝障礙［1］。AD 發(fā)病的關(guān)鍵因素Aβ的產(chǎn)生及分泌與糖代謝障礙之間有非常密切的關(guān)聯(lián)，并且可以相互促進(jìn)［2］。胰島素通過與細(xì)胞膜上的胰島素受體(insulin receptor，IR)相結(jié)合，通過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)特定的生理生化反應(yīng)。近年越來越多的研究［3］表明，腦內(nèi)胰島信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常在SAD的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。

胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphated-cAMP response element binding protein，p-CREB)是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。在以往的系列研究［5-6］中發(fā)現(xiàn)，本課題組自行設(shè)計(jì)合成的APP5肽類似物P165以及胰島素增敏劑羅格列酮具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，并可能與其改善胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞模型，觀察APP5肽類似物P165和羅格列酮對胰島素信號通路相關(guān)因子IRS-1和p-CREB表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1)細(xì)胞株:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。

2)試劑:鏈尿佐菌素購自Merck公司，羅格列酮購自葛蘭素史克公司，APP5肽類似物P165由本室自行設(shè)計(jì)，固相法合成，高效液相色譜純化(HPLC)。

IRS-1、p-CREB抗體由本室合成多肽片段，經(jīng)HPLC純化后與血蘭蛋白交聯(lián)，免疫兔獲得抗血清。山羊抗兔IgG/Dylight購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1)細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃ ，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d傳代1次，中間換液1次。

2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):將生長良好、傳代穩(wěn)定的SH-SY5Y細(xì)胞以2×103/mL的密度接種于48孔板(Nunc產(chǎn)品)，每孔體積500 μL，48 h后分為4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。包括:對照組、STZ神經(jīng)元損傷模型組(STZ 0.8 mmol/L)、羅格列酮保護(hù)組(STZ 0.8 mmol/L+羅格列酮20 μmol/L)，APP5肽類似物 P165保護(hù)組(STZ 0.8 mmol/L+P165 30 μmol/L)，各組細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)液體積均相等。

3)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察:倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的形態(tài)。

4)免疫細(xì)胞熒光染色:將生長良好、傳代穩(wěn)定的SH-SY5Y細(xì)胞以2×103/mL的密度接種于48孔板(Nunc產(chǎn)品)，每孔體積500 μL，當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%匯合率時，終止培養(yǎng)。PBST洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBST洗5 min×3次，5%山羊血清封閉1 h，分別加入一抗，即IRS-1抗體(1∶200)、p-CREB抗體(1∶200)。4 ℃過夜，PBST洗5 min×3次，滴加相應(yīng)的二抗(1∶200)，常溫避光反應(yīng)2 h，PBST洗5 min×3次，熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。用顯微圖像分析系統(tǒng)對各組進(jìn)行圖像分析，每組隨機(jī)選取300個細(xì)胞，采用image-pro plus圖像分析軟件測量平均吸光度(OA)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以中位數(shù)(M)和四分位數(shù)(P25，P75)表示，因數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布資料，故采用多個獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.008，以P＜0.008為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

接種后的SH-SY5Y細(xì)胞呈單個細(xì)胞，密度均勻漂浮在培養(yǎng)液中，體積較小、圓形、透亮，24 h貼壁后細(xì)胞長出較長突起，呈梭形、不規(guī)則的三角形或多邊形。至第3天與對照組相比，STZ損傷組細(xì)胞生長分裂減慢、突起縮短，細(xì)胞胞體皺縮。APP5肽類似物P165保護(hù)組和羅格列酮保護(hù)組突起伸展，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞胞體皺縮現(xiàn)象與STZ損傷組相比有所改善。

2.2 IRS-1和p-CREB抗體的免疫細(xì)胞熒光染色

IRS-1和p-CREB抗體免疫熒光染色后，細(xì)胞呈淡綠色熒光，說明SH-SY5Y細(xì)胞中存在IRS-1和p-CREB的表達(dá)。與對照組相比，STZ損傷組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較弱，而P165保護(hù)組和羅格列酮保護(hù)組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較強(qiáng)(圖1，2)。

平均吸光度值測定結(jié)果顯示:與對照組相比，STZ損傷組IRS-1和p-CREB平均吸光度值降低(P＜0.008)，與STZ損傷組相比，P165組和羅格列酮組平均吸光度值有所上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.008)(表1，2)。

表1 APP5肽類似物P165和羅格列酮對STZ損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞IRS-1表達(dá)的影響Tab.1 Effects of P165 and rosiglitazone on the expression of IRS-1 in SH-SY5Y

表2 APP5肽類似物P165和羅格列酮對STZ損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞p-CREB表達(dá)的影響Tab.2 Effects of P165 and rosiglitazone on the expression of p-CREB in SH-SY5Y

3 討論

SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其細(xì)胞形態(tài)及生理、生化功能與正常神經(jīng)元相似，并且存在胰島素受體和胰島素信號通路相關(guān)蛋白，已廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)的研究［7］，因此，我們應(yīng)用 STZ損傷 SHSY5Y細(xì)胞的胰島素受體，制備神經(jīng)元胰島素信號通路障礙的損傷性模型，從而觀察與老年性癡呆發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的變化。

APP5肽類似物P165是本課題組自行設(shè)計(jì)合成、并進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的小分子神經(jīng)營養(yǎng)肽，前期工作［6，8］證明，其具有改善腦內(nèi)胰島素抵抗、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。本研究通過細(xì)胞形態(tài)的觀察以及免疫細(xì)胞熒光染色的分析，探討在胰島素受體損傷導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙情況下，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白IRS-1和p-CREB表達(dá)的變化，并進(jìn)一步觀察APP5肽類似物P165對上述指標(biāo)的干預(yù)作用，結(jié)果表明，P165可以提高IRS-1和p-CREB的表達(dá)，改善神經(jīng)元生長狀態(tài)。

羅格列酮(rosiglitazone)屬噻唑烷二酮類化合物(thiazolidinediones，TZDs)，作為胰島素增敏劑，可增加組織細(xì)胞對胰島素的敏感性，降低胰島素抵抗［9］。Pedersen W A等［10］觀察了羅格列酮對Tg2576小鼠(一種AD的轉(zhuǎn)基因動物模型)的作用，發(fā)現(xiàn)治療6周，雖不能改變淀粉樣斑塊的病理變化，但可以選擇性地降低腦Aβ42的水平，本課題組的前期工作也發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)神經(jīng)元的作用［5］。在本次實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察了此藥物對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的影響，結(jié)果顯示，羅格列酮可以改善IRS-1和p-CREB的表達(dá)水平。

綜上所述，本課題組自行設(shè)計(jì)的APP5肽類似物P165及胰島素增敏劑羅格列酮可能通過增加IRS-1、p-CREB的表達(dá)來改善STZ對于SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

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