趙建強， 張王剛， 何愛麗， 張文娟， 古流芳 (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科， 西安 710004)

急性單核細胞白血病(AML-M5)是急性髓性白血病中較常見的類型，臨床特征突出表現(xiàn)為髓外病變、高白細胞計數(shù)、完全緩解率低、無病存活時間短。1998年歐洲11q23異常協(xié)作組(11q23 EUW)報道，約80%11q23異常AML患者為M4/M5亞型，證實11q23異常與單核細胞分化密切相關(guān)［1］。雖然11q23異常與M5明顯相關(guān)，但11q23異常在M5中的發(fā)生率僅6% －8%，且迄今已報道MLL基因受累的11q23染色體易位有75種，克隆到MLL基因的伙伴基因39個［2］;這些結(jié)果提示檢測發(fā)生重排的MLL基因只適用于極少數(shù)的M5患者。迄今為止對急性單核細胞白血病(M5)尚未找到其他確定的特異分子標記物。為篩選和鑒定出急性單核細胞白血病表達率高、特異性強的白血病相關(guān)抗原，我們成功構(gòu)建了M5的cDNA表達文庫，通過SEREX法篩選出35條與AML-M5抗原相關(guān)的基因［3］。應(yīng)用高通量ELISA(crELISA)技術(shù)對這些抗原新基因進行抗體特異性表達的小樣本檢測，鑒定出具有特異性抗體、陽性率高的M5抗原新基因MLAA-34［3］，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一個新的剪接變體［4］;應(yīng)用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和急性單核細胞白血病發(fā)生相關(guān)的新的抗凋亡分子［4］。

MLAA-34在急性髓細胞白血病尤其在AML-M5的表達模式迄今還不是十分明確，本研究旨在構(gòu)建敏感而且可靠的熒光定量 RT-PCR方法，檢測MLAA-34基因在AML-M5患者中表達水平的變化，分析其與AML-M5化療緩解、復(fù)發(fā)及預(yù)后的關(guān)系，探討其在臨床的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2008－01～2010－01間在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科收治的初診的患者，AML-M5患者35例，非AML-M5急性髓細胞白血病患者40例，經(jīng)臨床、骨髓形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)染色及免疫分型檢查確診，部分病例還進行了染色體核型分析。男性43例，女性32例;年齡18－71歲，中位年齡46歲。同時期非惡性血液系統(tǒng)疾病患者骨髓標本12例，健康志愿者外周血單個核細胞來自本院健康教職工和學(xué)生共10例作為正常對照。來自本院血液科實驗室冷凍保存的人急性單核細胞白血病細胞系U937作為陽性對照。骨髓及外周血單個核細胞收集后－80℃留存?zhèn)溆茫腥藛T均獲知情同意并簽署書面同意書。

1.2 誘導(dǎo)治療方案、療效的判定及療效的觀察

AML-M3由于其不同于其他亞型AML的特殊發(fā)病機制采用全反式維甲酸和/或砷劑的標準方案誘導(dǎo)治療［5］。除 AML-M3之外的低危 AML化療方案:MAE(米托蒽醌+阿糖胞苷+依托泊苷)、HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷);高危AML化療方案:MAED(米托蒽醌+阿糖胞苷+依托泊苷+地塞米松)、MMED(米托蒽醌+甲氨蝶呤+依托泊苷+地塞米松)。誘導(dǎo)緩解治療及第一個化療療程不足的患者，視為放棄治療;誘導(dǎo)緩解治療完成及第一個化療療程后觀察療效及緩解率，納入統(tǒng)計指標。療效觀察按照張之南等的血液病診斷及療效標準［6］，分為完全緩解(CR)，部分緩解(PR)和未緩解(NR)三組。隨訪時間為180 d。白血病復(fù)發(fā)的診斷指標是:骨髓白血病細胞＞5%，但＜20%，經(jīng)有效的抗白血病治療一個療程仍未達CR者;骨髓白血病細胞＞20%;或臨床出現(xiàn)髓外白血病浸潤(骨髓及血象仍正常)三項之一。

1.3 主要試劑 淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque)購自上海試劑二廠;Trizol試劑購自Invitrogen公司;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒One Step RNA PCR Kit購自大連Takara公司;pMD18-T載體購自Promega Biotech公司。

1.4 方法 應(yīng)用 RT-PCR方法對 AML-M5、非 M5的AML、非白血病的其他血液疾病患者及正常對照的MLAA-34 mRNA的表達水平分別進行檢測并加以比較。對AML-M5患者不同病程階段(初診、完全緩解、部分緩解或未緩解及復(fù)發(fā))的MLAA-34 mRNA的表達水平進行檢測并分析。同時對部分AML-M5患者的MLAA-34 mRNA表達水平進行了動態(tài)監(jiān)測。

1.4.1 骨髓及外周血單個核細胞(PBMC)的分離、RNA提取 EDTA抗凝的骨髓液2－3 ml或外周血5 ml在離心管中加入等量的淋巴細胞分離液，1 200 r/min離心20 min后，小心提取中間云霧狀白色單個核細胞層，PBS洗滌2次;如紅細胞及血小板較多，可加入紅細胞裂解液1 ml充分混勻后離心;Trizol提取細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量及濃度。

1.4.2 cDNA的合成 按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進行，逆轉(zhuǎn)錄體系 20 μl包括總 RNA 1 μg，Oligo(dT)引物 50 μmol/L，RNA 酶抑制劑 20 U，5 ×MMLV緩沖液2 μl，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U。70℃10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min冰上冷卻終止反應(yīng)。

1.4.3 PCR引物及探針 目的基因 MLAA-34、管家基因β-actin引物根據(jù)DNA序列設(shè)計，并經(jīng)過美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLAST程序驗證其特異性，MLAA-34基因的引物、探針及陽性標準品均由廣東中山大學(xué)達安基因公司設(shè)計并合成。管家基因β-actin的引物及探針由Takara公司合成。MLAA-34引物序列:上游為5'－AAG CCG GAG AAC CTG AAA CTC －3'，下游為5'－TGA GGA CTG GCC ACA AAC AC－3'，探針序列為5'－FAM －TGA TGA ACC TCC TTC GGG ATA AAA GTATAMRA－3';β-actin引物序列:上游為 5'－TCC TTC CTG GGT ATG GAATC －3'，下游為 5'－GCA CTG TGT TGG CAT AGA GG －3'，探針序列為5'－FAM－CGG ATG TCA ACG TCA CAC TTC ATGATAMRA －3'。

1.4.4 實時熒光RT-PCR檢測 建立陽性標準品:以高表達MLAA-34的人急性單核細胞白血病細胞系U937為對象，提取其總RNA、反轉(zhuǎn)錄、PCR特異性擴增MLAA-34、β-actin基因片段，連接入pMD18-T載體，測序，構(gòu)建含有MLAA-34、β-actin基因片段的陽性重組質(zhì)粒，擴增，確定其拷貝數(shù)濃度;多重實時熒光定量RT-PCR條件的優(yōu)化:對MLAA-34、βactin引物進行 5×106，10×106，20×106pmol/L 3種不同濃度的測試，以確定在實時熒光定量儀上進行反應(yīng)時產(chǎn)生的信號效果;設(shè)定探針濃度為50，100，200 nmol/L，以優(yōu)化反應(yīng)條件，并選擇能產(chǎn)生最高信號強度且無非特異性擴增的最適探針濃度;構(gòu)建標準曲線:將經(jīng)測序證明為陽性的重組質(zhì)粒進行倍比稀釋，分別稀釋成拷貝數(shù)為 104，105，106，107，108，109/μl，構(gòu)建 MLAA-34、β-actin 的標準曲線，并確定模板數(shù)的最佳線性范圍，已使模板在上述拷貝數(shù)范圍之間，與相應(yīng)的Ct值具有良好的相關(guān)性;MLAA-34的PCR反應(yīng)體系:5×定量 Buffer 10 μl，上下游引物、探針各 1 μl，dNTP、Taq 酶各 1 μl，cDNA 5 μl，加雙蒸水 30 μl使反應(yīng)總體系為 50 μl。反應(yīng)條件為:93℃ 2 min，然后93℃ 30 s，55℃ 1 min，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，任選4－5個陽性模板標準梯度點分析，若相關(guān)系數(shù)r＞0.97，表明線性關(guān)系良好，可確定為標準曲線，根據(jù)標準曲線得出樣本熒光定量反應(yīng)的絕對定量值，定量的單位按拷貝數(shù)/μl cDNA計算。每份標本均進行復(fù)管檢測，取其均值作為MLAA-34的表達水平。β-actin基因的RTPCR體系及反應(yīng)條件同MLAA-34，反應(yīng)40個循環(huán)。1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(M)描述，采用Kruskal Wallis test及Mann-Whitney test檢驗分析各組間差異，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組間MLAA-34 mRNA表達比較 結(jié)果顯示，MLAA-34在AML-M5組表達顯著高于正常對照組、非惡性血液疾病組及非AML-M5組的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

表1 不同組別MLAA-34 MRNA的表達水平Tab 1 Expression of MLAA-34 MRNA in different groups

2.2 MLAA-34 mRNA在AML-M5患者不同病程階段的表達 如表2所示，初治AML-M5患者MLAA-34 mRNA表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)。AML-M5復(fù)發(fā)患者MLAA-34 mRNA表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，略高于AMLM5初治組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。初治AML-M5患者經(jīng)誘導(dǎo)化療獲得完全緩解(CR)的患者MLAA-34 mRNA表達水平較治療前明顯下降(P＜0.05)，但仍高于正常對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 MLAA-34 mRNA在AML-M5的表達水平Tab 2 Expression level of MLAA-34 mRNA in AML-M5 patients

2.3 MLAA-34基因表達與誘導(dǎo)治療療效的關(guān)系初治75例AML患者中，12例未能完成首療程治療或放棄治療，余63例(AML-M5 30例，non-M5 33例)患者化療一個療程后完全緩解42例，完全緩解率為65.8%。完全緩解(CR)組與部分緩解(PR)及未緩解(NR)組MLAA-34表達水平分別為1.86×10－3和6.32 ×102，二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 MLAA-34基因mRNA表達水平的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果 對13例AML-M5患者進行動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，初診AML-M5時MLAA-34呈高度表達者，CR后MLAA-34表達水平可下降1個數(shù)量級以上，未達到緩解的患者其MLAA-34表達水平下降不顯著，維持在較高的水平。在復(fù)發(fā)的8例M5患者中，5例患者初診化療前MLAA-34表達水平較高，化療后達完全緩解后MLAA-34表達水平顯著下降，CR后180 d內(nèi)血象及骨髓象提示復(fù)發(fā)，檢測其MLAA-34表達水平也再次上升(圖1A);而其余3例M5患者初診時MLAA-34表達水平較高，CR后迅速或緩慢下降一個數(shù)量級，臨床復(fù)發(fā)前90 d，血象及骨髓象復(fù)查處于緩解期，而MLAA-34表達水平卻具有上升趨勢，之后才出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)(圖1B)。

圖1 動態(tài)監(jiān)測MLAA-34基因mRNA表達水平Fig 1 MLAA-34 expression levels in the patients with clinical relapse

3 討論

急性單核細胞白血病相關(guān)抗原新基因MLAA-34 cDNA全長1 671 bp，用生物信息學(xué)方法分析，其有完整的ORF框，編碼一個含有337個氨基酸殘基的蛋白質(zhì);MLAA-34定位于13q14.2，在此基因座位上，存在一個基因鈣結(jié)合蛋白39(calcium binding protein 39-like，CAB39L)，而 CAB39L 是一個功能未知的新基因。應(yīng)用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和急性單核細胞白血病發(fā)生相關(guān)的一個新的抗凋亡分子。

本研究采用特異的TaqMan探針來定量PCR，TaqMan探針與PCR引物對內(nèi)側(cè)的一段序列同源，并在5'端連接一個報告熒光(如FAM)，而在3'端連接一個淬滅熒光(如TAMRA)，當此探針保持完整時，報告熒光釋放的熒光能被淬滅熒光所吸收，因此檢測不到報告熒光的熒光信號。PCR擴增中Taq-Man探針結(jié)合于靶分子上，引物延伸過程中，由于TaqDNA聚合酶5'－3'外切核酸酶活性使得TaqMan探針被水解，報告熒光和淬滅熒光分離，從而使報告熒光信號能被檢測到，并隨著PCR循環(huán)次數(shù)的增加熒光信號也增加，通過構(gòu)建已知拷貝數(shù)的系列標準品的標準曲線就可以達到定量未知標本的目的。TAMRA在PCR過程中的變化很小，所以檢測過程中的熒光信號很穩(wěn)定，從而提高了檢測的重復(fù)性［7］。目前，臨床上已廣泛應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測白血病標志分子慢性粒細胞白血病(BCRABL)［8］、急性粒細胞白血病部分分化型(AML1-ETO)［9］、急性粒細胞白血病(PML-RARα)［10］、T 細胞性急性淋巴細胞白血病(HOX11)［11］等以進行相應(yīng)類型白血病的分子診斷、療效判斷及微小殘留病的檢測等。

對AML-M5患者35例，非AML-M5急性髓細胞白血病患者40例，非惡性血液系統(tǒng)疾病患者12例和健康正常對照10例外周血單個核細胞的MLAA-34表達檢測的結(jié)果顯示，MLAA-34在初診AML-M5患者其基因表達水平顯著高于對照組，與我們先期應(yīng)用SYBR GreenⅠ熒光染料法的實時熒光定量RTPCR技術(shù)對急性單核細胞白血病檢測發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因mRNA在AML-M5型白血病細胞中是特異性高表達的結(jié)果是一致的，表明該基因在AML-M5中的表達具有較高的特異性，可代表一種白血病候選標志，用于臨床鑒別診斷或疾病的篩查。另外，本研究通過檢測AML－M5不同階段MLAA-34基因表達水平，發(fā)現(xiàn)初診組和復(fù)發(fā)組顯著高于緩解組及正常對照組，復(fù)發(fā)組與正常對照組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義，說明監(jiān)測MLAA-34基因變化對于了解病情、判斷預(yù)后有指導(dǎo)意義。跟蹤觀察13例M5患者，發(fā)現(xiàn)持續(xù)血液學(xué)CR患者MLAA-34基因表達水平在正常范圍或附近波動;MLAA-34基因表達水平明顯高于正?；虺掷m(xù)增高均提示復(fù)發(fā)。雖在較低水平但在略超出正常水平波動的患者是否以后易復(fù)發(fā)，有待進一步觀察。MLAA-34 mRNA水平能夠很好地顯示療效并預(yù)測病情進展:治療過程中隨著白血病細胞比例的減少，MLAA-34 mRNA的水平亦隨之下降;發(fā)生臨床復(fù)發(fā)的患者復(fù)發(fā)前MLAA-34 mRNA始終維持在正常水平以上或有逐步上升超出正常的過程。因此，MLAA-34 mRNA水平能夠反映白血病負荷，作為臨床治療決定、療效判斷的一項指標。

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