易 洋,鮑運(yùn)平,龔朝霞朱正榮,彭禮林,駱華松 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院荊州市第一人民醫(yī)院骨科,湖北荊州434000)李軍川 (長江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院荊州市第一人民醫(yī)院病理科,湖北荊州434000)

骨折一號方是我科協(xié)定方,臨床實(shí)踐證實(shí)其療效卓著,為進(jìn)一步深入研究骨折一號方的作用機(jī)理,我們設(shè)計了本次實(shí)驗(yàn)。采用家兔橈骨中下1/3處1.5mm骨質(zhì)缺損的動物模型,應(yīng)用組織學(xué)、免疫組化方法對骨折一號方對骨折愈合的作用和骨折愈合過程中骨痂血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達(dá)的影響進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)藥物 骨折一號方由荊州市第一人民醫(yī)院制劑科提供。處方組成:澤蘭、二花、紅花、三七等。用傳統(tǒng)煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,備用。生理鹽水、青霉素 (華北制藥)均由荊州市第一人民醫(yī)院藥劑科提供。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 VEGF、BMP-2試劑盒 (即用型,武漢博士德生物有限公司提供)、臺式自動平衡離心機(jī)LDZS-2(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、HC-TP12B-1型天平 (北京醫(yī)用天平廠)、全自動切片機(jī)RMZ145(德國萊卡)、電熱恒溫水箱BHW(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)、全自動病理切片包埋機(jī) (德國萊卡EGll60)、DJS-941型電動石膏鋸 (長江大學(xué)提供)、電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-1(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)、顯微鏡MICROPHOT-FXA(日本NIKON)、外科常用器械 (由長江大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 選擇健康8月齡雄性新西蘭大白兔60只,體質(zhì)量2.5～3.0kg,由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境下 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心),自由進(jìn)食顆粒飼料,飲消毒水,室溫控制在 (20±2)℃,濕度60%,12-12間隔照明,定期紫外線消毒與排風(fēng)。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型 實(shí)驗(yàn)動物用0.3%戊巴比妥鈉按30mg/kg體質(zhì)量耳緣靜脈注射麻醉后建立動物模型,右側(cè)橈骨術(shù)野處剪毛,2%碘酒、70%酒精消毒,取前臂外側(cè)切口,暴露橈骨中段,注意保護(hù)橈動、靜脈,用兩把骨膜剝離子將橈骨撬起,DJS-941型電動石膏鋸造成橈骨中段1.5mm的骨缺損。以出現(xiàn)假性關(guān)節(jié)為準(zhǔn)。徹底止血,關(guān)閉切口。手術(shù)過程均在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。術(shù)后分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食,不做固定。術(shù)后進(jìn)行3d抗感染治療,給予青霉素80萬單位肌肉注射,1次/d。造模成功后隨機(jī)分為3組,空白組 (A組)、生理鹽水對照組 (B組)和骨折一號方組 (C組),每組20只。

1.2.2 給藥方法 用傳統(tǒng)煎藥方法,制成含生藥量為2g/ml,按 “動物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”[1]折算成等效劑量,2ml/100g體質(zhì)量灌胃,從造模后第1天開始,2次/d,直至動物被處死。

1.2.3 標(biāo)本處理 術(shù)后第3、6、9、14天每組隨機(jī)抽取5只家兔,采用空氣栓塞法處死,取樣時均截取右側(cè)橈骨,包括原骨折斷端及遠(yuǎn)近端各長約1.5cm的正常骨質(zhì),并剔除其上的軟組織。置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40g/L的多聚甲醛 (含1‰DEPC)4℃下固定24h。

1.2.4 組織學(xué)檢查 以骨折端中央為中心縱行剖開骨段,經(jīng)系列酒精脫水、透明、浸蠟,剖面向下,低熔點(diǎn)石蠟包埋。用萊卡自動切片機(jī)切成厚度6μ m的蠟片,將蠟片分別展于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上,標(biāo)明相應(yīng)的組織號碼,置于干燥箱中,42℃烤片48h。采用HE染色對各組標(biāo)本的骨折愈合情況進(jìn)行觀察評價。

1.2.5 VEGF表達(dá)檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)的VEGF免疫組化S-P試劑盒對標(biāo)本VEGF的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢查。

1.2.6 BMP-2表達(dá)檢測 采用武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)的BMP-2免疫組化S-P試劑盒對標(biāo)本BMP-2的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢查。

1.2.7 圖像分析 NIKON MICROPHOT-FXA顯微鏡的光源設(shè)定在電壓4.9V,物鏡固定為×40,光柵孔徑為0.25mm,曝光時間為0.165s,色溫為5500K,敏感度為M。拍攝在攝像機(jī)的鏡頭打開無組織和鏡頭完全被遮蔽狀態(tài)下的照片,作為光密度分析中黑色階和入射色階的校準(zhǔn)圖像。以骨折為中心對骨折斷端附近的骨干細(xì)胞、骨外膜、骨內(nèi)膜、血腫、纖維骨痂、軟骨骨痂、骨小梁、小梁間組織及骨髓組織各取兩個高倍鏡視野。用Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件,對陽性反應(yīng)細(xì)胞的平均光密度值(MOD)進(jìn)行分析。簡要分析步驟:打開Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件,用校準(zhǔn)圖像的灰度值設(shè)定光密度系統(tǒng)的黑色階和入射色階,并將光密度設(shè)為系統(tǒng)默認(rèn)值。打開需要測量的圖像,用選擇顏色中的吸管工具選擇圖像中的棕黃色陽性反應(yīng)區(qū)域,并保存選擇的顏色數(shù)據(jù),根據(jù)大量圖像調(diào)整顏色數(shù)據(jù),確定標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù),其他圖像用此數(shù)據(jù)自動選取圖像中陽性表達(dá)區(qū)域。使用AOI工具劃定需要測量的組織范圍,并手工去除噪點(diǎn)后計算該組織陽性表達(dá)細(xì)胞的MOD值,保存測量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

術(shù)后第3天,各組切片顯示以纖維組織為主,可見間充質(zhì)細(xì)胞增殖活躍,內(nèi)有毛細(xì)血管及炎性細(xì)胞;術(shù)后第6、9天,骨折一號方組膠原纖維較多,分化較成熟,對照組膠原纖維較少。術(shù)后第14天,骨折一號組有大量軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞,成纖維細(xì)胞多呈圓形,成骨細(xì)胞較大,細(xì)胞外基質(zhì)生成較多;空白組及對照組膠原纖維較多,軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)量相對較少,排列稀疏。

2.2 各組標(biāo)本骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)

各組標(biāo)本在骨折愈合不同時間點(diǎn)骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)情況見表1。

2.3 各組標(biāo)本骨干細(xì)胞BMP-2表達(dá)

各組標(biāo)本在骨折愈合不同時間點(diǎn)骨干細(xì)胞BMP-2表達(dá)情況見表2。

表1 不同觀察時間各組標(biāo)本骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)情況

表2 不同觀察時間各組標(biāo)本骨干細(xì)胞VEGF表達(dá)情況

3 討 論

骨折愈合是一個復(fù)雜過程,經(jīng)膠原合成、膠原纖維內(nèi)鈣化、骨化等,最終形成具有生物力學(xué)特性的骨組織[2]。近年的研究已經(jīng)證明,影響骨折愈合的因素有很多,但目前一般認(rèn)為血管方面因素可能是影響骨折修復(fù)的主要因素之一。已有研究表明,EGF可以促進(jìn)創(chuàng)傷后的血管生成和骨形成[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)中VEGF表達(dá)檢測結(jié)果顯示,骨折后斷端均有VEGF表達(dá)。術(shù)后第3、9天出現(xiàn)兩個峰值。我們對各時相點(diǎn)VEGF表達(dá)量作比較分析后發(fā)現(xiàn),試藥組較對照組各時相點(diǎn)VEGF表達(dá)量均明顯增高,表明骨折一號方有促進(jìn)骨折后VEGF表達(dá)的作用,且在VEGF表達(dá)量下降過程中可明顯減慢下滑速度,使局部VEGF高表達(dá)維持較長時間 (術(shù)后第14天)。我們推斷,骨折一號方在骨折愈合過程中,具有正向調(diào)高VEGF表達(dá)水平的能力,同時可減緩表達(dá)峰值后表達(dá)量下降的速度,延長局部VEGF高表達(dá)時間,促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖,使骨折斷端血循環(huán)重建及成骨過程加快,縮短骨折愈合時間。

BMP-2是公認(rèn)的最主要的骨形成調(diào)控因子,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證明BMP-2有很強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力[5-6]。本實(shí)驗(yàn)BMP-2表達(dá)檢測結(jié)果顯示,骨折后斷端均有BMP-2表達(dá)。我們所觀察的各時相點(diǎn)未出現(xiàn)峰值,而是呈兩條近乎平行線,隨時間的推移而呈增高趨勢。這可能與我們所選的觀察時相點(diǎn)相對短有關(guān)。在各時相點(diǎn),骨折一號方組BMP-2表達(dá)均高于對照組和空白組 (P＜0.05)。由此推測,骨折一號方對BMP-2的合成、分泌具有一定的干預(yù)作用,能增加其表達(dá)量,從而促進(jìn)骨折愈合和縮短骨折愈合時間。

綜上所述,骨折一號方能顯著增高骨折愈合各時相點(diǎn)VEGF、BMP-2的表達(dá)量,使骨折斷端血循環(huán)重建及成骨過程加快,這可能是其產(chǎn)生臨床療效的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)僅研究了骨折一號方對骨折早期的影響,其對骨折中后期的影響有待進(jìn)一步探討。

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