張海元,許光華,張 靜 (長江大學醫(yī)學院,湖北荊州434023)
順鉑 (cisplatin,DDP))是臨床應用最為廣泛的一種抗癌藥物,通過順鉑對腫瘤細胞作用的分子生物學研究顯示,鉑類藥物的主要作用機制是通過損傷DNA,使細胞進入G1期生長抑制,并誘導損傷嚴重的細胞進入凋亡狀態(tài)[1]。但順鉑副作用較大,順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴重損害,另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時易引起耐藥性,故臨床上如何減小順鉑的細胞毒性和耐藥性是目前面臨的重要課題。MS-275屬于苯甲酰胺類去乙酰酶 (HDAC)抑制劑,可上調(diào)p21基因的表達,對多個小鼠的人腫瘤模型都表現(xiàn)出強烈的抑瘤作用[2]。本課題擬采用低劑量的順鉑和MS-275聯(lián)合應用,以探討二者是否具有協(xié)同作用,是否能減少肝癌患者順鉑的使用劑量,降低順鉑對患者的毒副作用及耐藥性。通過本項目的實施,有望獲得全新的聯(lián)合抗腫瘤藥物治療方案。
H22肝癌細胞株由新加坡國立大學腫瘤研究所饋贈,小鼠腹水傳代。6~8周齡健康小鼠40只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22g。DDP購于錦州九泰藥業(yè)公司,MS-275購于德國Merck公司。
1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 無菌操作,取H22小鼠腹水,臺盼藍染色,光鏡下瘤細胞計數(shù),活瘤細胞>90%,調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml,分別取0.2ml于右腋皮下注射,制成實體型荷瘤鼠模型,2周后于小鼠右腋皮下形成H22肝癌細胞系移植瘤。
1.2.2 動物分組與治療 40只荷瘤小鼠隨機分成4組,即對照組 (生理鹽水0.2ml)、MS-275組(2mg/kg)、DDP組 (10mg/kg)、聯(lián)合治療組 (MS-275+DDP組),每組10只。每組荷瘤小鼠分別進行腹腔內(nèi)注射,每周2次,共2周。在最后一次注射治療結(jié)束后第2周,用頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠,觀察各項指標。
1.2.3 瘤重稱取及腫瘤抑制率的計算 小鼠處死后,分別取出腫瘤瘤體,剝離干凈后,用濾紙擦拭干凈,電子天平稱取瘤重,并按公式計算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%。
1.2.4 腫瘤組織細胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 切取上述各組小鼠腫瘤組織,分別經(jīng)40g/L戊二醛及10g/L四氧化鋨預固定和固定后,用乙醇及丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂包埋,制作0.5μ m厚薄切片,醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色,利用透射電鏡觀察。
1.2.5 免疫組化檢測 免疫組化染色采用SP法,參照SP免疫組化試劑盒說明書進行操作。切取小鼠腫瘤組織,用10%福爾馬林固定,石蠟包埋并切片,檢測移植瘤組織中半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達及微血管密度 (MVD)的測定。在MVD的測定中,用CD31抗體標記微血管。
免疫組化結(jié)果判斷:胞漿內(nèi)棕黃色顆粒為caspase-3、VEGF、CD31陽性表達 (CD31抗體標記血管內(nèi)皮細胞);微血管密度計算方法:棕黃色血管內(nèi)皮細胞或細胞族代表一條單獨微血管。
應用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,采用χ2分析檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
聯(lián)合治療組 (MS-275+DDP)小鼠腫瘤生長明顯受到抑制,移植瘤質(zhì)量為(0.96±0.12)g,抑瘤率為66.8%;DDP組移植瘤質(zhì)量為(1.52±0.19)g;MS-275組移植瘤質(zhì)量為(1.65±0.25)g,而對照組移植瘤質(zhì)量為(2.78±0.28)g。治療組與對照組比較具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05),聯(lián)合治療組 (MS-275+DDP)與MS-275組或DDP組比較差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。
透射電鏡觀察結(jié)果顯示,對照組細胞壞死,但部分細胞結(jié)構(gòu)完整,常染色質(zhì)豐富;MS-275治療組可見部分早期凋亡細胞;順鉑組可見細胞大量壞死,未見明顯細胞凋亡指征;MS-275+順鉑聯(lián)合治療組可見凋亡小體,細胞質(zhì)密度增高,染色質(zhì)高度凝集固縮。
用免疫組化SP法檢測各實驗組腫瘤組織Caspase-3及VEGF蛋白表達水平,其中細胞漿著色成棕黃色為陽性表現(xiàn)。實驗結(jié)果顯示,各治療組與對照組比較及聯(lián)合治療組與單獨應用順鉑或MS-275治療組比較,Caspase-3蛋白表達均具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05);另外,各治療組與對照組比較,VEGF蛋白表達明顯下調(diào),且均具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)。用CD31標記微血管密度 (MVD)的表達顯示,治療組與對照組比較及聯(lián)合治療組與單獨應用順鉑或MS-275治療組比較,均具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)。
表1 各組Caspase、VEG F、CD31(MVD)蛋白表達水平 %
肝細胞癌是常見的消化道惡性腫瘤,其發(fā)生是一個多因素、多階段、多基因變異的積累過程。肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展不僅存在細胞增殖與分化的異常,也與細胞凋亡異常密切相關(guān)[3]。MS-275是一種較新的苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑 (HDACIs),有誘導腫瘤細胞增殖阻滯、分化凋亡以及選擇性地作用腫瘤細胞等抗癌活性。據(jù)報道[4-5],MS-275已被證實對白血病和實體瘤進行治療,表現(xiàn)出良好的療效,不良反應的發(fā)生率及發(fā)生程度均極低,這說明與傳統(tǒng)的化療藥物相比HDACIs具有較大的優(yōu)勢。本課題組在前期的實驗中證明MS-275在肝癌細胞系Hep3B中能誘導p21WAF1/CIP1表達,加速腫瘤細胞凋亡[6],并對多個小鼠的人腫瘤模型上都表現(xiàn)出強烈的抑瘤作用。Sato等[7]應用MS-275聯(lián)合順鉑治療口腔鱗狀細胞癌,證實兩類藥物可通過不同途徑作用于腫瘤細胞,具有協(xié)同作用,對化療藥物起到減毒增效的功效。研究表明[8],肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展及細胞凋亡與腫瘤的新生血管生成程度密切相關(guān),血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有重要意義。腫瘤內(nèi)血管生成受多種相關(guān)基因/蛋白的調(diào)控,它們共同調(diào)節(jié)肝細胞癌的生物學行為,其中血管內(nèi)皮細胞生成因子在腫瘤血管生成中發(fā)揮主要作用。VEGF是由腫瘤細胞分泌,通過與血管內(nèi)皮上的相應受體結(jié)合促進內(nèi)皮細胞增殖,同時可增加血管通透性使內(nèi)皮細胞遷移,誘導腫瘤血管生成,維持腫瘤的繼續(xù)生長,是目前發(fā)現(xiàn)的最強烈的血管生成因子,與諸多生理及病理過程有關(guān)。而微血管密度被認為是能反映腫瘤血管生成的一個指標,能反映干細胞癌的侵潤和轉(zhuǎn)移能力,且與VEGF的表達呈正相關(guān),被認為是一種新的腫瘤生物學特征[9]。故針對癌細胞凋亡或抑制癌內(nèi)新生血管形成的治療將成為抑制肝細胞癌生長的熱點。
肝細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中微環(huán)境的改變可以影響腫瘤細胞的凋亡狀態(tài),是通過激活一系列基因、啟動各種機制而誘導肝癌細胞凋亡,其中Caspase蛋白起著極其重要的作用[10]。本研究通過在小鼠體內(nèi)移植肝細胞癌,并分別采用化療藥物順鉑、組蛋白去乙?;敢种苿㎝S-275及聯(lián)合用藥 (DDP+MS-275)等方法進行治療,結(jié)果顯示,聯(lián)合治療組小鼠腫瘤生長明顯受到抑制,移植瘤質(zhì)量為(0.96±0.12)g,抑瘤率達到66.8%,與順鉑治療組和MS-275治療組比較差異具有統(tǒng)計學意義,本實驗結(jié)果說明化療藥物順鉑和MS-275聯(lián)合應用在抑制干細胞癌瘤體生長和增加抑瘤率中都發(fā)揮明顯療效,明顯抑制干細胞癌的增殖生長,起到明顯的協(xié)同效應。在使用透射電鏡觀察移植瘤超微結(jié)構(gòu)來看,聯(lián)合治療組可見凋亡小體,細胞質(zhì)密度增高,染色質(zhì)高度凝集固縮,相比于單獨使用順鉑組或MS-275組而言,凋亡特征非常明顯。用免疫組化SP法檢測各實驗組腫瘤組織Caspase-3蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組中Caspase-3表達明顯上調(diào),推測聯(lián)合應用順鉑和MS-275治療肝細胞癌移植瘤過程中,通過不同途徑誘導腫瘤細胞凋亡并發(fā)揮協(xié)同作用可能是實現(xiàn)其對肝癌細胞抑制作用的機制之一。
肝細胞癌是惡性腫瘤,侵潤和轉(zhuǎn)移是其主要生物學特征,也是影響肝細胞癌患者治療效果和預后的重要因素,而肝細胞癌內(nèi)新生血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有重要意義。本研究用免疫組化SP法檢測各實驗組腫瘤組織VEGF蛋白表達水平,實驗結(jié)果顯示,各治療組與對照組比較,VEGF蛋白表達明顯下調(diào),且均具有統(tǒng)計學差異。另外,用CD31標記微血管密度 (MVD)的表達顯示,治療組與對照組比較及聯(lián)合治療組與單獨應用順鉑或MS-275治療組比較,均具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)。本研究結(jié)果說明,聯(lián)合治療組可通過明顯下調(diào)VEGF蛋白表達,減少腫瘤細胞MVD,對小鼠移植肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展有顯著抑制作用。
通過本實驗的研究,聯(lián)合應用MS-275及化療藥物順鉑治療小鼠肝細胞癌移植瘤,可能通過不同途徑及機制作用于肝癌細胞,加速腫瘤細胞凋亡,并抑制腫瘤內(nèi)新生血管形成,控制肝細胞癌的生長、侵潤和轉(zhuǎn)移,為肝細胞癌的治療提供新的靶點和全新的聯(lián)合用藥方案。
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