西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

郭少賢 劉永惠 常 靖△ 夏欣欣 王 瑞 華 莎 （西安 710061）

腫瘤的增殖、轉移,與腫瘤微環(huán)境有十分重要的關系,對腫瘤微環(huán)境的研究已成為目前研究的熱點之一,而腫瘤細胞持續(xù)缺氧可以誘導新生血管生成,可能為腫瘤增殖、轉移提供一定的環(huán)境與條件?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認為,腫瘤及其轉移存在血瘀證,與腫瘤增殖、轉移存在正相關關系。為深入研究血瘀證與腫瘤微環(huán)境及腫瘤的增殖、轉移的關系,本實驗應用麝香酮干預血瘀證裸鼠乳腺癌組織血管生成相關因子 VEGF、bFGF的表達,探討麝香酮對腫瘤微環(huán)境的影響,進一步闡述其抗腫瘤增殖、轉移的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞系 雌性裸鼠40只,體重 （20±2）g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號碼SCXK（滬）2007-0005,飼養(yǎng)于動物實驗室 SPF環(huán)境中。乳腺癌MDA231細胞株購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 藥物 麝香酮購自德國Dr（批號 90527CY）,腎上腺素購自上海禾豐制藥有限公司 （批號 H 31021062）。

1.3 儀器與試劑 SCW-BCM生物超凈工作臺系蘇州市長春電子儀器廠生產(chǎn);臺式多功能離心機系長沙市鑫奧儀器儀表有限公司生產(chǎn);普通光學顯微鏡購自日本 Olympus公司;電熱恒溫水浴箱 DR-HW-2購自北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠;CO2細胞培養(yǎng)箱購自上?？亓饪萍加邢薰?VEGF一抗及bFGF一抗購自北京康為世紀生物科技有限公司;VEGF二抗及bFGF二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4方法

1.4.1 細胞培養(yǎng):乳腺癌 MDA 231細胞株用含 10%胎牛血清的 RMPI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),細胞長滿單層后用 0.25%胰酶消化,培養(yǎng)液吹打離心,收集細胞用 PBS稀釋,濃度調至 5×106。

1.4.2血瘀模型:將 40只裸鼠分成兩組,空白組 10只,皮下注射生理鹽水 0.2 mL/只,連續(xù) 7日;血瘀組 30只,皮下注射 0.01%腎上腺素 0.2mL/只,連續(xù) 7日。[1]

1.4.3 測定指標與方法:隨機選取血瘀組中 10只裸鼠和空白組 10只裸鼠,眼球取血脫臼處死。由于 1只裸鼠的血量不足 1個檢測樣本,故將同組的 2只裸鼠的血樣合并成 1個樣本,每組各為 5個樣本,由本院的檢驗科測定。全血黏度測定:取血 3mL,用適量肝素粉抗凝,在血液流變儀上,測定在切變率為 1S-1、5S-1、30S-1、200S-1的全血黏度。

1.4.4 接種與給藥:將其余 20只裸鼠,每只裸鼠于右后背部皮下接種細胞液 0.2mL。接種 10天腫瘤長至 1mm3時,隨機分為兩組,血瘀加瘤組 10只;麝香酮組 10只。給藥劑量均采用人與動物計量換算法確定。①血瘀加瘤組:每天灌胃生理鹽水 0.2 mL,連續(xù) 14天。②麝香酮組:麝香酮給予 2mg∕kg灌胃,連續(xù) 14天。

1.4.5 免疫組化:脫臼處死余下 20只裸鼠,取出瘤體,放入 4%多聚甲醛固定液中,經(jīng)組織脫水、透明、滲蠟、石蠟包埋,以 5μm厚度連續(xù)切片,免疫組化采用 SP法,按照試劑盒說明書檢測VEGF及 bFGF的表達。用PBS作為一抗做陰性對照。

1.4.6 結果判定:VEGF免疫組化染色以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性,結果評分,陽性細胞范圍分為 0～3級:無陽性細胞為 0,1%～10%為 1,11%～50%為2,51%以上為 3;染色強度分為 0～3級,陰性為 0,弱陽性為 1,中度陽性為 2,強陽性為 3,[2]兩者之和即為該片的 VEGF免疫組化評分,bFGF的表達也采用該評分標準。

2 結果

2.1 血液流變學 空白組與血瘀組血液流變學結果經(jīng)t檢驗后,兩組在 1S-1、5S-1、 30S-1、 200S-14個指標間差異均有顯著性 （P＜0.05）,可以認為兩組的全血黏度有差異,詳見表 1。

2.2 VEGF和bFGF在血瘀加瘤組、麝香酮中的表達情況 經(jīng) t檢驗后,麝香酮組與血瘀加瘤組比較差異均有顯著性 （P＜0.05）,詳見表 2。

表1 血液流變學結果 （±s）

表1 血液流變學結果 （±s）

指標 空白組 血瘀組1S-1 29.47±7.28 46.02±10.94 5S-1 9.66±2.71 14.54±3.08 30S-1 4.21±1.50 6.11±3.46 200S-1 2.09±1.34 3.97±1.67

表2 VEGF和 bFGF結果 （±s）

表2 VEGF和 bFGF結果 （±s）

指標 血瘀加瘤組 麝香酮組VEGF 5.34±0.23 2.90±0.25 bFGF 4.52±0.35 2.23±0.38

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認為,氣滯血瘀為其發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一。研究表明腎上腺素多次小劑量皮下注射模擬長期肝氣不疏,氣滯不能行血,導致裸鼠全血黏度增高,血液處于黏、稠狀態(tài),形成血瘀證。[1]研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞生長的高代謝需求導致微環(huán)境出現(xiàn)缺氧,而血瘀證的病理基礎是血液凝固—纖溶—血小板功能紊亂,[3]加重腫瘤細胞微環(huán)境缺氧的狀態(tài)。缺氧誘導因子 （HIF-1）是細胞對于缺氧反應的最基本物質之一。它在惡性腫瘤中普遍存在,是缺氧誘導基因表達的中心調節(jié)因子,[4]表達受到缺氧、癌基因和抑癌基因、生長因子等多種因子的調節(jié),可調控有關腫瘤血管生成、能量代謝等多種靶基因的轉錄、促進腫瘤生長、浸潤和轉移。

H IF-1屬于 bHLH-PAS家族成員,是由 α亞單位（HIF-1α）和 β亞單位 （HIF-1β）組成的異源二聚體蛋白[5]。HIF-1β是許多bHLH蛋白的共同亞單位,不受氧水平的影響,在正常細胞和缺氧細胞的胞質和胞核中均有表達;HIF-1α是唯一的氧調節(jié)亞單位,在常氧條件下,細胞雖不斷的合成 HIF-1α,但經(jīng) pVHL的介導而被泛素 -蛋白酶體系統(tǒng)迅速降解;在缺氧狀態(tài)下,由于不發(fā)生自身羥基化降解被阻止,轉入核內與HIF-1β結合形成有活性的HIF-1,HIF-1通過與其靶基因的啟動子或增強子的缺氧反應元件結合而發(fā)揮其轉錄活性,從而調節(jié)腫瘤細胞的缺氧效應。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)實體瘤 HIF-1蛋白高表達,如直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、腦腫瘤、腎臟腫瘤等,而在相鄰的正常組織或基質細胞中均不能測及。H IF-1的表達程度與腫瘤的惡性程度、新生血管的表達程度、腫瘤的侵襲能力及預后不良成正相關。

惡性腫瘤在發(fā)生、發(fā)展及轉移的過程中,新生血管形成及對缺氧的耐受性是至關重要的。H IF-1通過與有關腫瘤血管形成的基因結合,使其表達升高,VEGF和 bFGF在腫瘤新生血管形成中起關鍵作用。VEGF是最重要的促進腫瘤血管形成的因子,分為 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子 （PGF）,VEGF在正常成人組織呈低水平表達,但在腫瘤組織中呈高表達。VEGF結合受體FLt-1和KDR,直接誘導內皮細胞增殖、遷移,增加血管通透性,促使血漿纖維蛋白外滲,增加血管外纖維性凝膠從而支持內皮細胞生長,有利于血管生成。[6]bFGF是目前已知最強的促血管形成因子之一,與細胞膜上受體結合,刺激內皮細胞產(chǎn)生血漿素原激活物和膠原酶,降解血管基底膜;誘導血管內皮長入膠原基質中,形成和毛細血管類似的管腔;刺激平滑肌增殖,使新生血管成熟。

血瘀證與惡性腫瘤存在密切關系,研究表明,腫瘤血瘀證主要與腫瘤患者的微循環(huán)障礙,高凝狀態(tài),血小板功能紊亂相關,同時與腫瘤新生血管等腫瘤微環(huán)境也存在重要關系。經(jīng)過長期中醫(yī)藥對腫瘤治療的臨床研究,發(fā)現(xiàn)活血化瘀藥物在防治腫瘤中起積極作用,通過影響血瘀證本質即通過調節(jié)腫瘤患者血液凝固狀態(tài) -纖溶 -血小板的平衡,特別是可能抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮其藥效。本實驗結果顯示麝香酮對腫瘤新生血管生成有明顯的抑制作用。麝香酮是麝香的主要活性成分,具有芳香行氣、通經(jīng)活絡、對抗缺氧損傷的功能。麝香酮通過芳香行氣的作用,活血化瘀,改善血液的 “高凝狀態(tài)”,降低血小板黏附、聚集,改善纖維蛋白含量,增加纖維蛋白溶解及血流量,[7]改善腫瘤細胞微環(huán)境缺氧的狀態(tài),使 HIF-1低表達,進而,VEGF和 bFGF表達減少,從而發(fā)揮抑制腫瘤新生血管生成的作用。目前麝香酮能抑制腫瘤的新生血管生成文獻報道較少。故這一重要研究結論預示麝香酮在抑制腫瘤新生血管生成中具有較好的應用前景。

[1] 和嵐,蔣文躍,毛騰敏.注射腎上腺素模擬 “氣滯”復制急、慢性血瘀模型初探 [J].中國中西醫(yī)結合雜志,2004,24（3）:244-245

[2] 左朝輝,黎祖榮,周曉.環(huán)氧合酶 -2抑制劑塞來昔布對人肝癌 HepG2裸小鼠移植瘤生長和腫瘤血管生成的抑制作用[J].癌癥,2006,25（4）:414-420

[3] 劉永惠,楊曉峰,周冬枝 .腫瘤血瘀證實質及活血化瘀治則的研究 [J].河北中醫(yī),2002,24（4）:252-254

[4] 王敬儉,李靜,耿美玉.靶向缺氧誘導因子 -1的抗腫瘤藥物研究進展 [J].藥學學報,2008,43（6）:565-569

[5] 朱小康,韓福生.缺氧誘導因子 -1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用 [J].蚌埠醫(yī)學院學報,2010,35（2）:211-214

[6] 廖子君,雷光焰.腫瘤轉移學 [M].西安:陜西科學技術出版社,2007.165-171

[7] 劉永惠,鄧景元,鄒鵬 .張玉五教授治療腫瘤學術思想探究 [J].河北中醫(yī)藥學報,2006,21（4）:31-33

（2011-04-22 收稿）