李求知,杭柏林,王青,胡建和

（1.輝縣市畜牧局,河南輝縣 453600；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003）

豬水腫?。╡dema disease of pigs,ED）,是由某些特定血清型產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌（Shiga-like toxinEscherichia coli,SLTEC）引起的小豬的一種腸毒血癥,以頭部、眼瞼、耳部等處水腫、共濟(jì)失調(diào)和急性死亡為主要特征[1-2].該病發(fā)病率不高,但病死率很高,給豬的養(yǎng)殖造成很大損失,成為危害養(yǎng)殖業(yè)的一大難題[2].仔豬水腫病病原血清型較多,各地流行菌株不盡相同,血清型之間的交叉保護(hù)性不高,菌苗的免疫效果并不理想.因此,一般通過(guò)抗生素治療仔豬水腫病.然而,不合理使用抗生素易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,使得治療越發(fā)困難[3].2010年6月至8月,輝縣市幾個(gè)豬場(chǎng)出現(xiàn)了斷奶仔豬突然死亡的病例,從病豬的臨床癥狀和剖檢病變方面初步診斷為仔豬水腫病.為了確診該病,進(jìn)行了病原分離與鑒定,并進(jìn)行了耐藥性檢測(cè),旨在為防治該病提供幫助.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料采集 肝、脾、肺、心、血液等病料采集自輝縣市幾個(gè)豬場(chǎng)的疑似仔豬水腫病病死豬,共16份病料.用保溫杯加冰袋冷藏保存,并于3 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室,保存于4℃,24 h待檢.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、微量生化反應(yīng)管等購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司.藥敏紙片、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和枸櫞酸鹽培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自行制備并保存,各種抗生素購(gòu)自河南科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院,TaqDNA聚合酶、dNTPs、Taq buffer和DNAMarker等均為大連寶生物公司產(chǎn)品.其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑.

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 22只試驗(yàn)用小白鼠（16～20 g）購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.1.4 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 使用文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)的特異性引物,序列見(jiàn)表1,引物由大連寶生物公司合成.

表1 引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臨床癥狀及病理變化的觀察 臨床癥狀主要觀察發(fā)病豬的精神狀態(tài)、食欲、體溫、呼吸、運(yùn)動(dòng)等情況；病理變化的觀察通過(guò)解剖病、死豬,觀察胃底黏膜、胃大彎、胃賁門部、心包、胸腔、腹腔等的病理變化情況.

1.2.2 細(xì)菌的分離 將血液用滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,取不同稀釋度的稀釋液0.5mL,用涂布法接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.心、肝、肺和脾臟用剪刀以燙灼法進(jìn)行表面消毒,以無(wú)菌鑷子取一小塊組織,用涂布法接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況和菌落特征.挑取單個(gè)菌落接種于麥康凱瓊脂平板,37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,挑取紅色、中等大小、光滑的可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色和鏡檢.同時(shí)挑取單個(gè)菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18～24 h,挑取黑色、帶金屬光澤的中等大小菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色和鏡檢.革蘭染色、形態(tài)、大小及菌落培養(yǎng)性狀等均符合大腸桿菌菌株的特征,初步確定為大腸桿菌,并用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂純化,以供作細(xì)菌生理生化鑒定.

1.2.3 細(xì)菌生化試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行.對(duì)疑似大腸桿菌的菌株進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、維倍（VP）試驗(yàn)、硫化氫（H2S）試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和5種糖類發(fā)酵試驗(yàn).

1.2.4 細(xì)菌致病性試驗(yàn) 為了鑒定所分離的大腸桿菌是否具有致病性,使用小白鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn).按照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行.將生化鑒定為大腸桿菌陽(yáng)性的菌株純培養(yǎng)物接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)18～24 h,用滅菌生理鹽水洗下,調(diào)節(jié)菌懸液的細(xì)菌濃度約為2.0×108CFU/mL,通過(guò)腹腔途徑注射5只健康小白鼠0.5 mL/只.對(duì)照組小白鼠注射等量的滅菌生理鹽水.小白鼠死亡后進(jìn)行剖檢觀察,將病變明顯組織按方法1.2.1中心包、肝臟和脾臟的方法進(jìn)行接種,若培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)和生理生化鑒定等均符合大腸桿菌的菌株則判定為致病性大腸桿菌.

1.2.5 菌落PCR 按照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行.用滅菌牙簽輕輕從麥康凱培養(yǎng)基上挑取于37℃培養(yǎng)16～18 h、中等大小、粉紅色典型菌落于PCR反應(yīng)體系中混勻,直接用于PCR擴(kuò)增.反應(yīng)體系：模板為牙簽挑取的適量菌落,Taq酶（2U/L）0.5μL,dNTPs（2mmo1/L）1μL,MgC12（25mmo1/L）1.0μL,10×Taq buffer（不含Mg2+）2μL,各對(duì)引物中每種引物 1.0μL（10μmol/L）,加滅菌雙蒸水至 20μL.反應(yīng)步驟：95℃4min,94℃lmin,58℃lmin,72℃lmin,25個(gè)循環(huán)后,72℃延伸l0min,4℃保存待鑒定.

取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1/6體積的DNA電泳上樣緩沖液混勻,點(diǎn)入配制好的瓊脂糖凝膠樣品孔中,在1×TAE電泳緩沖液中加以5～10 V/cm的電場(chǎng)使DNA樣品向正極泳動(dòng)30～60min.電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照像.

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用圓紙片法進(jìn)行.取37℃培養(yǎng)18 h的致病性大腸桿菌,置于1mL滅菌生理鹽水中,充分混合后用移液槍吸取150μL,均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面.待瓊脂表面干燥后,用滅菌鑷子小心取已備好的各種藥敏紙片,每個(gè)藥敏紙片設(shè)3個(gè)重復(fù).37℃恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈直徑.判定標(biāo)準(zhǔn)[7]：抑菌圈直徑大于20mm為極度敏感,15.1～20mm為高度敏感,10.1～15mm為中度敏感,0～10mm為耐藥.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病豬的臨床癥狀與病理變化

發(fā)病豬只精神高度沉郁,食欲廢絕,體溫達(dá)38～39℃,眼瞼紅腫,步態(tài)失調(diào),繼而臥地不起,四肢劃動(dòng)呈游泳狀,呼吸快而淺,進(jìn)而口吐白沫,叫聲嘶啞,后抽搐而死.剖檢病死豬,可見(jiàn)胃底黏膜彌漫性出血,胃大彎和賁門部水腫,切開(kāi)水腫部,黏膜層和肌層之間有一層膠胨樣水腫液；心包、胸腔、腹腔有淡色積液,暴露空氣中5min后即凝結(jié)成膠胨樣；膀胱黏膜輕度充血.根據(jù)以上臨床癥狀和病理變化參照文獻(xiàn)[2]初步判斷為仔豬水腫病.

2.2 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)結(jié)果

在16份疑似豬水腫病的病料中,10份病料中的細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出灰白色、圓形、稍隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑約1～2mm）,在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出磚紅色、圓形隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落,在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出深黑色、圓整、濕潤(rùn)、中等大小、具有黃綠色金屬光澤的菌落,在半固體培養(yǎng)基中可見(jiàn)穿刺線周圍的培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng),呈倒三角形狀.將以上培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)涂片,革蘭染色后鏡檢,見(jiàn)到革蘭陰性、中等大小的桿菌.將培養(yǎng)特征和鏡檢特征比對(duì)文獻(xiàn)[8]中大腸桿菌的特征描述,認(rèn)為分離到疑似大腸桿菌菌株10株.

2.3 細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果

10株疑似大腸桿菌菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表2所示.將10株疑似菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[8]中大腸桿菌生理生化特性的描述進(jìn)行比對(duì),確定分離到的10株疑似大腸桿菌菌株均為大腸桿菌.

表2 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分離菌株的致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠在2～3 d內(nèi)都出現(xiàn)了一些變化,精神沉郁,體溫升高,采食量大幅減少,7 d后全部死亡；而對(duì)照組全部正常存活,這說(shuō)明接種菌株為致病性菌株.解剖死亡小白鼠,可見(jiàn)肝臟腫大、邊緣鈍圓,腸道彌漫性出血.采用麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,在平板上形成粉紅色或磚紅色,表面光滑,圓整,隆起,濕潤(rùn)和中等大小的菌落.經(jīng)鏡檢和生理生化鑒定為大腸桿菌.這表明,所分離到的10株大腸桿菌均具有致病性.

2.5 菌落PCR結(jié)果

經(jīng)菌落PCR后,從10株菌株中均擴(kuò)增出510 bp大小的條帶（見(jiàn)圖1）,說(shuō)明這10株大腸桿菌為致仔豬水腫病的病原.

圖1 FedA亞基PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

2.6 分離菌株的耐藥性分析

10株致病性大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示.從表3中可以看出,就受試抗生素而言,所分離的10株大腸桿菌對(duì)青霉素和阿莫西林均耐藥,對(duì)慶大霉素、阿米卡星、沙拉殺星、洛美沙星和頭孢噻呋均沒(méi)有耐藥性.第 1、2、3、9 株為兩重耐藥,第 4、6、7、8、10 株為三重耐藥,第 5 株為四重耐藥.9 種抗生素中敏感性較高的是洛美沙星,極度敏感的有2株（2/10）,高度敏感的有8株（8/10）；其次是慶大霉素,極度敏感的有1株（1/10）,高度敏感的有7株（7/10）.

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

該研究首先對(duì)疑似仔豬水腫病的病、死仔豬進(jìn)行臨床癥狀和病理變化的觀察,再通過(guò)觀察分離菌株的形態(tài)、分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、小白鼠感染試驗(yàn)和PCR鑒定,最終確定引起該豬場(chǎng)仔豬發(fā)病的病原為豬水腫病大腸桿菌.通過(guò)細(xì)菌分離、生理生化試驗(yàn)、小白鼠試驗(yàn)后得到的結(jié)論是所分離菌株是致病性大腸桿菌,但卻不能確定是導(dǎo)致仔豬水腫病的病原.FedA是F18ab（F107ab）菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因,而F18ab菌毛與仔豬水腫病有關(guān)[9],是致水腫病大腸桿菌的主要毒力因子之一[10].因此,若通過(guò)PCR擴(kuò)增出FedA基因,則能表明所分離的大腸桿菌為導(dǎo)致仔豬水腫病的病原.本試驗(yàn)正是通過(guò)這一原理證實(shí)了所分離的菌株為仔豬水腫病病原.

通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物用于治療大腸桿菌病是目前常用的方法[2].藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,從這幾個(gè)豬場(chǎng)分離到的菌株對(duì)不同的抗生素產(chǎn)生了耐藥性,有的還是多重耐藥,但是仍然有對(duì)所分離菌株都比較敏感的抗生素,如洛美沙星和慶大霉素.目前,動(dòng)物源性大腸桿菌耐藥性呈現(xiàn)出以多重耐藥為主的趨勢(shì)[11].因此,中藥和其它抗生素替代品是未來(lái)用防治大腸桿菌病的希望.

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