楊 洋，陳 娜，李春杰

(農(nóng)業(yè)部草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020)

禾草內(nèi)生真菌是一類在植物體內(nèi)度過(guò)大部分或全部生命周期，而寄主植物不顯示外部癥狀的一類真菌[1]，其依靠寄主獲得養(yǎng)分，寄主也因?yàn)槭艿絻?nèi)生真菌刺激而增強(qiáng)抗逆性[2]，宿主與植物之間有著錯(cuò)綜復(fù)雜的共生關(guān)系[3]，與周圍環(huán)境之間有著密切的相互作用[4]。內(nèi)生真菌作為一類新的微生物資源引起了各國(guó)科研工作者的廣泛關(guān)注。大量對(duì)禾草內(nèi)生真菌共生體的研究表明，內(nèi)生真菌增強(qiáng)了共生體的生態(tài)適應(yīng)性[5]，同時(shí)能夠?yàn)橹参飵?lái)多種有益特性，如增強(qiáng)宿主植物抗病蟲(chóng)害能力[6-7]、抗旱[8]、抗寒[9]以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[10]，提高植物產(chǎn)量，增強(qiáng)其競(jìng)爭(zhēng)力等[11]。因此，發(fā)掘和探索新的禾草內(nèi)生真菌共生體是內(nèi)生真菌這一新的微生物資源有效利用的前提條件。

中華羊茅(Festucasinensis)是禾本科多年生疏叢型草本植物，為我國(guó)西北、華北、東北和青藏高原等地的常見(jiàn)野生牧草[12]，由于其耐寒冷，適應(yīng)性強(qiáng)，適口性好，耐放牧，是卓越的混播用草種，現(xiàn)已作為高寒牧區(qū)草地生產(chǎn)建設(shè)的優(yōu)良栽培牧草。并且中華羊茅在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)耐熱、耐旱、耐寒，許多品種具有草坪草的特征，如植株低矮、葉叢發(fā)達(dá)、春季返青早，秋季枯黃晚，耐踐踏，再生性強(qiáng)，抗病性強(qiáng)[13]，是很好的草坪建植草種，尤其在寒地型草坪群落中利用較多[14]。盡管中華羊茅感染內(nèi)生真菌早已報(bào)道[15]，但其感染的內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定至今仍是空白。因此對(duì)這些特性的深入研究有助于了解內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)的共生機(jī)制，了解禾草-內(nèi)生真菌共生體的共生特征，為內(nèi)生真菌在草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)[16]。

研究表明，不同植物體內(nèi)分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量和種類不同，少則幾種，多則幾十甚至上百種[17],然而從同種植物不同個(gè)體分離到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量也有差異。禾草內(nèi)生真菌形態(tài)多樣性的相關(guān)研究有很多，但對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌的研究報(bào)道僅見(jiàn)于金文進(jìn)等[18]對(duì)其菌落生長(zhǎng)的生物學(xué)與生理學(xué)特性的研究，而其多樣性的研究尚屬空白。因此，作為高寒地區(qū)的重要牧草，對(duì)其內(nèi)生真菌的研究亦十分必要。

本研究通過(guò)對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)，從菌落形態(tài)指標(biāo)和個(gè)體形態(tài)指標(biāo)等方面對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌各個(gè)菌株之間的形態(tài)多樣性作了初步探討，旨在為進(jìn)一步研究中華羊茅-內(nèi)生真菌共生體及內(nèi)生真菌與宿主之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 中華羊茅成熟植株及種子于2008年9月采集自甘肅甘南的甘加草原(甘加)和?？撇菰?桑科)，并將采回的種子在5 ℃條件下保存于農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量檢測(cè)中心種子貯藏室。成熟的中華羊茅植株用于進(jìn)行內(nèi)生真菌檢測(cè)，種子用于內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌的檢測(cè) 參照李春杰[19]的方法，通過(guò)對(duì)400份植物樣本的種子和莖髓部的檢測(cè)，加苯胺藍(lán)染液染色，在顯微鏡下觀察生長(zhǎng)于植物組織間的菌絲體。同時(shí)，收集帶菌植物樣本的種子用于播種，檢測(cè)4周齡幼苗的帶菌率。

1.2.2供試菌株的分離培養(yǎng) 將中華羊茅種子先于70%乙醇消毒5 min，再浸于6%的次氯酸鈉中消毒10 min，最后用無(wú)菌水沖洗 3次，將消毒好的種子播種于PDA培養(yǎng)基中，每皿20粒，置于25 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。每日觀察，及時(shí)移除生長(zhǎng)快，易被雜菌污染的種子。40 d后培養(yǎng)基上陸續(xù)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢的白色菌落，將其轉(zhuǎn)入新鮮PDA培養(yǎng)基中進(jìn)一步純化，保種待用。分離得到的菌株在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)4周，觀察菌落特征，記錄生長(zhǎng)速度。在水瓊脂培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫條件下進(jìn)行產(chǎn)孢，3周后觀察分生孢子的著生特點(diǎn)，測(cè)量并記錄分生孢子及孢子梗的形態(tài)學(xué)特征。

1.2.3內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定和聚類分析 聚類分析是根據(jù)研究對(duì)象的特征對(duì)其進(jìn)行分類的一種分析技術(shù)，將相近性質(zhì)的個(gè)體分為一類，使得高度同質(zhì)性的個(gè)體成為一類，則不同類間有著較高異質(zhì)性。在對(duì)分離菌株進(jìn)行聚類的過(guò)程中，將菌落形態(tài)、分生孢子大小、分生孢子梗長(zhǎng)度等可甄別不同菌株的觀測(cè)指標(biāo)作為統(tǒng)計(jì)量，根據(jù)這些指標(biāo)作為聚類的依據(jù)，將相似度不同的菌株進(jìn)行依次劃分，直到聚合完所有指標(biāo)。采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，建立親緣關(guān)系樹(shù)圖。在解剖鏡及顯微分析系統(tǒng)下觀察菌落特征和生殖器官的顯微結(jié)構(gòu)，參考與分離菌株相似種的原始文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒定，并結(jié)合宿主植物的特性，參照模式菌株的特征鑒定其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1中華羊茅內(nèi)生真菌的檢測(cè)與分布 在對(duì)400份植物樣品的所有地上部分的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)帶菌率達(dá)到了98%，葉鞘、莖稈、種子里都檢測(cè)到了內(nèi)生真菌的存在。在葉鞘及莖稈組織中，菌絲細(xì)長(zhǎng)，單行，粗細(xì)均勻，分隔明顯，少分叉，呈波浪狀彎曲，平行于細(xì)胞長(zhǎng)軸排列在細(xì)胞間隙中，未發(fā)現(xiàn)菌絲體穿透植物細(xì)胞或細(xì)胞層(圖1)。在種子中，菌絲體分布于糊粉粒細(xì)胞之間，菌絲粗細(xì)不均勻，分布無(wú)序，彎曲程度較高(圖2)。所有植物材料中均未見(jiàn)有真菌子座產(chǎn)生，也沒(méi)有觀察到菌絲體周圍的植物細(xì)胞有壞死、變色等癥狀。真菌菌絲體生活在宿主細(xì)胞間隙，并不破壞宿主細(xì)胞。初步認(rèn)為是禾本科植物的Neotyphodium內(nèi)生真菌菌絲。對(duì)采集到的野生中華羊茅樣品的葉片、葉鞘和莖稈部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，都能得到相應(yīng)的菌株，這表明中華羊茅內(nèi)生真菌在其宿主植物的各組織內(nèi)普遍存在，且在植物地上部分也有著系統(tǒng)的分布。此外，在感染內(nèi)生真菌的種子當(dāng)中發(fā)現(xiàn)大量典型的內(nèi)生真菌菌絲體，并且對(duì)帶菌樣本的種子播種后的4周齡幼苗進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，幼苗的帶菌率分別為90.4%和89.5%(表1)，說(shuō)明中華羊茅中所帶的內(nèi)生真菌能夠通過(guò)宿主植物的種子進(jìn)行垂直傳播，這也證明了中華羊茅-內(nèi)生真菌共生體在自然界中形成了穩(wěn)定的共生體系。

表1 中華羊茅成株、種子及幼苗內(nèi)生真菌帶菌率

2.2中華羊茅內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)特征 本研究中的供試菌株分離自甘肅甘南主要牧區(qū)天然草地采集的中華羊茅，共得到菌株48株，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)4周后可形成具有典型特征的菌落，獲得表型穩(wěn)定的菌株，菌落特征及孢子形態(tài)見(jiàn)表2。

表2 分離菌株的主要形態(tài)學(xué)特征

在PDA培養(yǎng)基上，菌落在外觀和生長(zhǎng)特征上均存在著一定差異。菌落顏色多為白色，少數(shù)為淺灰色；質(zhì)地有的呈棉狀，有的為更加致密氈狀，有的菌落產(chǎn)生少量的氣生菌絲，有的則無(wú)；從菌落正面有的中心高度隆起、表面的菌褶如同腦狀，有的則緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)呈蠟狀。分離得到的48個(gè)菌株無(wú)論從菌落顏色、質(zhì)地等表型特征，還是從孢子形態(tài)及孢子大小，都呈現(xiàn)出了豐富的多樣性(表2)。最終根據(jù)培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)特征，可以將分離菌株劃歸為3個(gè)形態(tài)群，聚類結(jié)果見(jiàn)圖3，具體形態(tài)特征描述如下：

ZHYM-Ⅰ型：25 ℃培養(yǎng)4周，菌落直徑為12～16 mm，生長(zhǎng)速度緩慢。菌落正面白色，棉狀，質(zhì)地緊密，中央隆起如腦狀，表面褶皺或有回溝，背面深褐色或近黑，有龜裂(圖4)。水培養(yǎng)4 周后,Ⅰ型菌株菌絲體可產(chǎn)生成熟孢子。分生孢子單個(gè)頂生，呈彎鉤形或鐮刀形，孢子平均大小(7.5～17.9)μm×(1.4～2.3) μm。菌絲基部生出分生孢子梗，直立或略彎曲，頂部較細(xì)，大小(10.5～18.1) μm×(1.3～2.1) μm，底端無(wú)隔，營(yíng)養(yǎng)菌絲光滑透明，直徑1.0～2.1 μm (圖5)。

ZHYM-Ⅱ型：25 ℃培養(yǎng)4周，菌落直徑為17～23 mm，生長(zhǎng)速度較快。菌落正面白色棉狀，質(zhì)地緊密光滑，緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，菌落背面褐色，有龜裂(圖4)。菌絲體水培養(yǎng)4周后產(chǎn)生成熟孢子。分生孢子單個(gè)頂生，呈半月形、舟形或腎形，孢子平均大小為(5.0～13.0) μm×(1.9～3.0) μm。分生孢子梗略彎曲，頂部較細(xì)，大小為(18.0～27.5) μm×(0.9～2.5) μm，底部無(wú)隔，營(yíng)養(yǎng)菌絲光滑透明，直徑為0.9～2.6 μm (圖5)。

ZHYM-Ⅲ型：25 ℃培養(yǎng)4周，菌落直徑為15～26 mm，生長(zhǎng)速度較快。菌落正面白色或灰白色，蠟狀，緊密光滑，菌落背面褐色(圖4)。菌絲體水培養(yǎng)4周后產(chǎn)生成熟孢子。分生孢子單個(gè)頂生，無(wú)色透明呈橢圓或腎形，孢子平均大小為(4.5～8.0)μm×(2.0～4.6) μm。分生孢子梗直立，頂端變尖，為(8.5～20.3) μm×(1.5～2.0) μm，基部無(wú)隔膜，營(yíng)養(yǎng)菌絲光滑透明，直徑1.3～2.5 μm (圖5)。

圖3 基于形態(tài)性狀的48株內(nèi)生真菌菌株聚類分析

圖4 從中華羊茅中分離出的內(nèi)生真菌菌落

圖5 中華羊茅內(nèi)生真菌的孢子及孢子梗形態(tài)

3 討論

本研究利用形態(tài)學(xué)的方法對(duì)從野生中華羊茅中分離出的內(nèi)生真菌做了初步鑒定，48個(gè)菌株可能均屬Neotyphodium屬內(nèi)生真菌，具體種的分類地位有待進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析后加以確定。

禾本科植物內(nèi)生真菌具有一定的組織特異性，只存在于植物的葉鞘、莖稈和種子糊粉層中，并且在不同部位的菌絲形態(tài)有一定的差別[20-21]。由于Neotyphodium屬內(nèi)生真菌數(shù)量較多，因此其不同種的內(nèi)生真菌，在菌落顏色、質(zhì)地、分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)和大小上差異明顯，能夠顯示出豐富的形態(tài)多樣性[22-23]。本研究對(duì)分離得到的所有菌株進(jìn)行了植物體內(nèi)分布特征、培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)特征以及表型特征的比較，并根據(jù)這些信息進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明，試驗(yàn)中分離得到的Neotyphodium屬內(nèi)生真菌在分生孢子和孢子梗的形態(tài)和大小范圍均有變化；在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度等方面也存在差異。說(shuō)明內(nèi)生真菌在與植物長(zhǎng)期的相互作用中顯示出了豐富的多樣性。金文進(jìn)等[18]曾對(duì)中華羊茅內(nèi)生真菌不同菌株之間，在相同溫度和pH值下，菌落生長(zhǎng)的差異、對(duì)碳源和氮源的利用能力以及不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢能力、產(chǎn)孢數(shù)量等方面做了研究，進(jìn)一步體現(xiàn)了中華羊茅內(nèi)生真菌的生物學(xué)與生理學(xué)特性方面的多樣性。在同種宿主植物中一般可分離到多種內(nèi)生真菌菌株[24]。本研究在野生中華羊茅中共分離出3個(gè)不同形態(tài)群的內(nèi)生真菌菌株，表明天然禾草中內(nèi)生真菌有著較高的多樣性，體現(xiàn)了中華羊茅內(nèi)生真菌豐富的種質(zhì)資源。在內(nèi)生真菌的分離過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，由于分離株間存在的基因異質(zhì)性導(dǎo)致同一分離株的內(nèi)生真菌在純化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多個(gè)形態(tài)群，且同一形態(tài)群內(nèi)的不同分離株的菌落形態(tài)也不相同?；蛲蛔円鸹虍愘|(zhì)性，這種現(xiàn)象在內(nèi)生真菌中廣泛存在，導(dǎo)致了同菌種不同分離株在形態(tài)和生物堿等代謝物的產(chǎn)生上有很大程度的不同[25]。菌落形態(tài)的差異同樣也是對(duì)基因異質(zhì)性的反映，48株中華羊茅內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)與生長(zhǎng)特性表現(xiàn)出了較高的多樣性，菌株的表型特征除了受到培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分組成影響之外，主要決定于自身的遺傳組成特征[26]，本研究中的菌株在相同條件下表現(xiàn)出各異的外部特征，很可能也是其遺傳多樣性的外在表現(xiàn)。

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