楊滿業(yè) ，王麗煥，葉煜輝，江明鋒，肖冰雪

(1.四川省草原科學研究院,四川 成都 611731; 2.西南民族大學生命科學與技術學院,四川 成都 610041)

賴草屬 (Leymus) 在國內又稱濱麥屬，是禾本科早熟禾亞科(Poaceae)小麥族，也稱大麥族大麥亞族多年生植物類群，全世界約有30余種，分布于北半球溫寒地帶，多數產于亞洲中部，少數分布于歐洲和北美。中國區(qū)域有賴草屬植物約20種，2個變種，劃分為3個組，即多穗組、少穗組和單穗組，主要分布于新疆、甘肅、寧夏、內蒙古、東北三省、四川、陜西、河北、山西[1]。賴草(L.secalinus)作為禾本科優(yōu)質牧草、生態(tài)草、小麥(Triticumaestivum)等農作物新品種選育的種質具有無性繁殖能力強、品質優(yōu)良、營養(yǎng)豐富、抗旱、抗寒、抗病蟲害、適應性強等優(yōu)良特性[2-4]。本研究利用抑制性消減雜交技術研究賴草干旱誘導下的基因表達差異，揭示賴草屬植物的抗旱分子機理，對加快我國抗逆新品種的開發(fā)，提高我國干旱和半干旱地區(qū)的植被蓋度、改良退化及沙化草地、改善西部生態(tài)環(huán)境、促進我國干旱地區(qū)草地畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料 賴草樣品植株采自四川省西北部高原沙地，地理位置31°51′ N，101°51′ E，海拔約3 500 m，采集后的賴草培養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱內,模擬高原氣侯特點并采用原產地的沙土進行培養(yǎng)。選擇生長旺盛的賴草植株并分成兩份，一份正常生長，一份進行干旱脅迫。在空氣相對濕度保持在40%～60%的情況下采用根際水分脅迫，連續(xù)脅迫5 d后，迅速剪取處理和對照組賴草的葉片，蒸餾水洗凈后裝入塑料袋中，并置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2抑制性消減雜交

1.2.1葉片組織RNA的提取 采用Invitrogen公司的Trizol試劑分別抽提處理和對照組賴草葉片組織的總RNA。

稱取賴草葉組織約0.6 g，將其剪碎后置于-20 ℃預冷的研缽中，倒入液氮并按100 mg/mL的量加入6 mLTrizol Reagent,研磨至粉狀，于室溫下靜置5 min待其完全融化，將液體移入1.5 mL EP管中，加入1/5 Trizol體積的氯仿，混勻，室溫下靜置5 min,12 000 r/min 4 ℃離心10 min，將上清液轉移至新的EP管中，并加入與上清液等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入1 mL的75%乙醇，混勻，12 000 r/min 4 ℃離心5min，棄上清液保留沉淀，干燥2～3 min，加入50～100 μL RNA-Free水進行溶解。儲存于-70 ℃?zhèn)溆肹5-6]。

1.2.2賴草葉組織cDNA的合成 采用SMART-cDNA合成技術合成賴草cDNA。所用SMART試劑盒購自clonetech公司。按照試劑盒說明書操作。

1.2.3抑制性消減雜交 用PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clonetech公司)進行消減雜交。

取處理和對照組樣品cDNA 2 μg，分別用Rsa I酶進行消化。處理組作tester，對照組作driver。取適量的tester,稀釋后分成兩份，分別與接頭Adaptor 1和Adaptor 2R連接，連接體積20 μL，16 ℃連接48 h。

Adaptor 1和Adaptor 2R與tester cDNA(200 ng/μL) 連接產物分別取1.5 μL，分別加入1.5 μL driver cDNA (600 ng/μL)和1 mL雜交緩沖液，加入30 μL礦物油覆蓋，進行第1輪雜交：98 ℃變性1.5 min，68 ℃孵育8 h?；旌蟽煞蓦s交液，并加入新鮮變性的1.5 μL driver cDNA (600 ng/μL)和1 μL雜交緩沖液，進行第2輪雜交：68 ℃反應12 h，將溶液稀釋于200 μL稀釋緩沖液中，72 ℃保溫7 min，-20 ℃保存。

1.2.4巢式PCR擴增消減雜交產物

第1輪抑制性PCR： 1 μL兩輪雜交后得到的cDNA作為模板，加入2 μL SSH PCR Primer，4 μL dNTP Mix,4 μL MgCl2，5 μL 10×EX Taq反應緩沖液，0.5 μL EX Taq酶，33.5 μL無菌水，總體積50 μL。反應參數：75 ℃ 6 min；(94 ℃ 40 s；68 ℃ 40 s；72 ℃ 1.5 min)×20循環(huán)。采用熱啟動，75 ℃預熱1 min后加酶。

第2輪抑制性PCR：上述產物取3 μL，加去離子水27 μL，稀釋10倍；取1 μL稀釋液作為第2次PCR反應模板；引物改為Nested PCR Primer 1和Nested PCR Primer 2R，其余成分同第1輪PCR。反應參數:(94 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s；72 ℃ 1.5 min)×15循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3消減文庫的構建

1.3.1與PMD18-T載體連接，篩選陽性克隆 將第2次抑制性PCR擴增產物直接連接到PMD18-T載體中。連接產物轉化E.coliJM109感受態(tài)細胞。37 ℃培養(yǎng)過夜，菌落PCR篩選陽性克隆，并保藏菌種。以Nested PCR primer 1和Nested PCR primer 2R為引物，用PCR法檢測陽性克隆，反應體系70 μL，PCR反應程序:96 ℃ 4 min；(94 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s；72 ℃ 1.5 min)×32循環(huán)，8 ℃保存。取PCR反應產物5 μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2斑點雜交篩選差異克隆 依據Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit II的使用說明，以約1 μL的DNA量標記，共標記2個探針：以干旱誘導樣品的第1輪抑制性PCR產物作模板標記DNA探針；以對照樣品的第1輪抑制性PCR產物作模板標記DNA探針。將兩張同樣大小的尼龍膜在ddH2O中浸潤 10 min，再在10×SSC中浸潤10 min，濾紙上自然晾干。取2 μL 1.3.1中制備的菌落PCR產物與2 μL 0.5 mol/L NaOH混勻，在預處理的2張尼龍膜上各點2 μL混合液，60 ℃烘干，至少10 min，取出放入紫外交聯儀中交聯30 s。將固定有DNA的尼龍膜置于預雜交液中，于37 ℃雜交箱中預雜交30 min。將地高辛標記的兩種DNA探針于100 ℃變性5 min，立即置于冰上，微離心，分別加入到雜交管中(終濃度50 ng/mL)，于37 ℃雜交箱中繼續(xù)雜交16 h。取出尼龍膜用2×SSC/0.1% SDS于室溫洗膜2次，每次5 min；用預熱至65～68 ℃的0.5×SSC/0.1% SDS于55 ℃洗膜2次，每次15 min；最后以2×SSC于室溫洗膜2次，每次5 min，以去除殘留的SDS。將尼龍膜放入平板，用20 mL maleic acid buffer完全浸泡2 min(15～25 ℃)再浸入1×Blocking solution中孵育30 min。再浸入1×Antibody solution繼續(xù)孵育20 min。將膜放入Washing buffer靜置平衡2～5 min。再將膜置于顯色液中1 min。暗室中顯色10～16 h。次日觀測結果。

1.4差異表達cDNA克隆序列的測定和分析 對斑點雜交陽性結果進行測序(北京三博遠志)，將測序結果與GenBank中的序列比較，序列分析用DNAMAN軟件。

2 結果

2.1總RNA的電泳檢測 提取的賴草葉組織RNA，經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統下紫外照相。結果發(fā)現，28S、18S條帶清晰可見(圖1)。經核酸蛋白濃度測定儀測定，對照賴草葉組織總RNA的A260 nm/280 nm=2.29；干旱誘導賴草葉組織總RNA的A260 nm/280 nm=2.19。以上結果表明，所提取的RNA可以滿足試驗要求。

圖1 賴草葉組織總RNA的電泳圖譜

2.2cDNA的合成、酶切 合成的賴草cDNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，整個條帶呈彌散分布，分布范圍為1 000～3 000 bp，表明可以進行下面的試驗。將經過Rsa I酶切的cDNA條帶與未進行酶切的條帶比較發(fā)現，干旱誘導組和對照組酶切后的cDNA條帶均下移(圖3)，片段變小，說明酶切效果良好可以滿足下面的試驗要求。

圖2 賴草葉組織cDNA電泳圖譜

2.3抑制性消減雜交 消減雜交后經兩輪PCR富集(圖4)，可以看出，經兩輪PCR后差異表達的cDNA得到了充分的富集。

2.4消減文庫的構建 將SSH方法得到的片段與PMD18-T載體連接、轉化，得到576個克隆。用巢式PCR引物進行菌落PCR，檢測陽性克隆。結果得到440個PCR片段(部分差異片段見圖5)，其插入比率為76.39%，其中250 bp及250 bp以上片段總數為304個，插入率為52.78%,表明消減文庫構建比較成功。

圖3 賴草葉組織cDNA及RsaI酶切后電泳圖譜

圖4 干旱誘導條件下的賴草葉片消減產物

圖5 賴草干旱誘導后差異表達cDNA文庫部分克隆的菌落PCR篩選電泳圖譜

2.5斑點雜交篩選差異表達克隆 將包含576個克隆在內的賴草干旱誘導前后差異表達cDNA文庫進行斑點雜交，比較同一位置的點的顏色深淺，按照試劑盒提供的方法確定差異表達片段。用對照組探針和干旱處理組探針與文庫雜交得到了539個雜交斑點(圖6)。

圖6 部分的斑點雜交結果

2.6差異表達cDNA克隆的測序、Blast對比分析 從539個雜交斑點中選擇20個雜交信號強弱差異明顯的克隆進行測序，去除測序結果相同的4個序列，將所測得的16個EST序列均提交到GenBank數據庫中，其接受號分布范圍在GO581265-GO581281(表1)。16個EST序列與GenBank中的序列進行BLAST比對分析，結果發(fā)現，有3個片段與其他植物干旱誘導條件下表達的序列具有較高的同源性，主要是大麥(Hordeumvulgare)和小麥,同源性在94%以上；1個片段與已知抗旱基因的甜菜堿醛脫氫酶部分核酸序列(GenBank登錄號：AB183716)有較高同源性；1個片段與植物熱激蛋白HSP70的核酸序列(GenBank登錄號：X67711.2)具有較高同源性，達86.67%；3個片段與植物光合作用的關鍵酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的部分氨基酸序列(GenBank登錄號：AAA62703)具有較高的同源性，達95%；1個片段與植物遍在蛋白綴合酶的部分氨基酸序列(GenBank登錄號：ACG41720)具有較高的同源性，同源性達99.5%；1個與植物50S核糖體蛋白L20基因片段(GenBank登錄號：Q6L378.2)有較高的同源性，達90%；3個為賴草屬內羊草(L.chinensis)cDNA文庫中所包含的基因片段；還有3個基因片段與其他植物如水稻(Oryzasativa)、小麥和擬鵝觀草屬(Pseudoroegneria)的基因有較高的同源性。

2.7部分差異表達基因片段的序列分析 將T1-4 G2序列在NCBI中進行BLAST-N比對發(fā)現，該序列共126 bp,與屬內另一個種——羊草的甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因LcBADH2(GenBank 登錄號：AB183716)的部分序列同源性較高，利用DNAMAN軟件進行分析，相似性達到90.48%。

T1-1 F8序列在NCBI中進行BLAST-X比對發(fā)現，該序列中有66 bp所編碼的22個AA與大麥1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)基因(GenBank 登錄號：AAA62703)的部分AA序列的相似性達到95%(21/22)。

T1-3 D5的反向互補序列在NCBI中進行BLAST-X比對發(fā)現，該序列中有66 bp所編碼的22個AA與水稻遍在蛋白綴合酶(GenBank 登錄號：ACG41720)的部分AA序列的相似性達到100%(22/22)。

將T1-2 D11序列在NCBI中進行BLAST-N比對發(fā)現，該序列共173 bp,與編碼水稻hsp70蛋白的基因(GenBank 登錄號：X67711.2)的部分序列同源性較高,利用DNAMAN軟件分析，相似性達到86.67%。

3 討論

Diatchenko等[5]于1996年提出的抑制性消減雜交技術，在比較同一類細胞在不同生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的基因表達方面已得到廣泛的應用，是一項較為成熟的技術。該技術能選擇性地擴增差異表達的cDNA片段，在富集目的基因的同時抑制非特異片段的擴增[7]。

本研究用抑制消減雜交與SMART等技術構建了包含576個克隆的賴草干旱誘導后差異表達cDNA文庫。將差異表達cDNA克隆進行斑點雜交，得到539個雜交斑點，通過對差異表達克隆的篩選、測序及序列比對，得到了3個與其他植物干旱誘導條件下表達的序列具有較高的同源性的序列，1個與已知抗旱基因的甜菜堿醛脫氫酶部分核酸序列有較高同源性序列。賴草經過干旱脅迫后，出現了與其他植物干旱脅迫后表達的類似基因[8-11]，說明本研究的誘導方法可靠。更重要的是獲得了賴草中甜菜堿醛脫氫酶的部分序列，而這個基因是目前廣泛研究的抗旱基因，所以這與預期研究結果吻合。另外測出的序列中包括1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶基因片段、遍在蛋白結合酶基因片段等都是植物在遭受干旱脅迫后會差異表達的基因，這也說明了植物在遭受干旱脅迫后發(fā)生的是一系列復雜的生理生化變化，而不僅僅是單一的水分代謝方面的變化[12-14]。

表1 賴草干旱誘導前后葉組織差異表達的EST

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