王亞賓，張 祥，胡清林，孟振北，陳麗穎，陳小麗，崔保安

(1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002;2.漯河出入境檢驗檢疫局，河南漯河450046)

腸球菌是一種重要的條件致病菌.近年來，由于腸球菌感染動物報道不斷增多［1～10］，尤其是耐藥性的不斷增加［11，12］，腸球菌逐漸引起人們的重視.以前研究發(fā)現(xiàn)豬感染糞腸球菌主要引起敗血癥，但國內外尚未見有引起關節(jié)炎的報道.2008年作者接檢了河南洛陽某豬場送檢的1頭仔豬，病豬除了跗關節(jié)腫大外，飲食、精神狀況和體溫等均未見異常，剖開患豬的發(fā)病關節(jié)，可見有多量的稀薄膿液.經細菌分離純化、生化特性鑒定及16SrRNA序列測定，最終確定為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)感染.

1 材料與方法

1.1 菌株

臨床分離株為河南洛陽某豬場送檢的1例關節(jié)腫大的病豬，無菌采取其關節(jié)液分離純化后，命名為 HE43.糞腸球菌標準菌株 ATCC29212，ATCC33186和CMCC(B)32223均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司惠贈，所有菌株加入體積分數50%甘油后由河南農業(yè)大學微生物實驗室于-70℃保存?zhèn)溆?

1.2 主要儀器和試劑

Vitek-32全自動細菌鑒定系統(tǒng)、革蘭氏陽性細菌鑒定卡(GPI;生產批號:B56K)，均為法國生物梅里埃中國有限公司產品.DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠).溶菌酶購自上海伯奧生物科技有限公司;2×PCR TaqMix購自北京美萊博醫(yī)學科技有限公司;pTG19-T載體購自上海捷瑞生物工程有限公司;膠回收試劑盒，Proteinase K，瓊脂糖，X-gal，IPTG、限制性內切酶 BamHⅠ和 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)購自瑞興科技有限公司;基因工程菌E.coli DH5α由河南農業(yè)大學微生物實驗室保存.胰蛋白胨大豆肉湯(TSB;生產批號200704038)、腦心萃取液態(tài)培養(yǎng)基(BHI;生產批號:200704102)，均系廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產品，按說明書配制;胰蛋白胨大豆鮮血瓊脂平板，按體積分數5%的鮮血量加入到胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基自配而成.

1.3 藥敏紙片

青霉素(10 IU·片-1)、氨芐西林(10μg·片-1)、紅霉素(15μg·片-1)、諾氟沙星(10μg·片-1)、萬古霉素(30μg·片-1)、替考拉寧(30 μg·片-1)、卡那霉素(30 μg·片-1)、四環(huán)素(30 μg·片-1)、頭孢噻肟(30 μg·片-1)、利富平(5 μg·片-1)、左氟沙星(5 μg·片-1)、呋喃妥因(300 μg·片-1)、先鋒霉素V(30 μg·片-1)、新霉素(30 μg·片-1)、強力霉素(30 μg·片-1)、氯霉素(30μg·片-1)、丙氟哌酸(5 μg·片-1)、多粘菌素B(300 IU·片-1)、磷霉素(200μg·片-1)、鏈霉素(300μg·片-1)、慶大霉素(120μg·片-1)，系杭州微生物試劑有限公司產品.

1.4 細菌特性和生化鑒定

無菌取病豬的關節(jié)液直接接種于普通瓊脂平板和腦心萃取液瓊脂平板，37℃溫箱微厭氧培養(yǎng)24 h.同時取病關節(jié)液和瓊脂平板上培養(yǎng)的細菌典型菌落涂片，革蘭染色后鏡檢.將分離純化的各菌株分別劃線接種于體積分數5%兔鮮血平板和點種在體積分數3%的明膠瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h后觀察溶血和明膠溶解情況.同時取分離株接種到BHIA平板上，培養(yǎng)后挑取典型菌落用質量分數0.45%NaCl滅菌鹽水配制成0.6麥氏單位，按Vitek-32要求進行生化鑒定.

1.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法.將菌株接種于TSA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h，然后用質量分數0.45%NaCl滅菌鹽水沖洗TSA瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，并調整濁度到0.5麥氏單位.用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液.用棉拭子涂布整個BHIA培養(yǎng)基表面，待菌液稍干燥后，將藥敏制片緊貼平板表面，每個平板5張藥敏片，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結果.藥敏結果按美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI，2006)的標準進行判斷.其中，卡那霉素判斷標準參照紅霉素，頭孢唑林和頭孢噻肟參照青霉素的標準.在21種臨床常用藥物中(氯霉素在獸醫(yī)臨床上已禁用，本次主要是根據CLSI建議做敏感性分析使用).

1.6 16S r RNA基因的PCR擴增與測序

參照文獻［13，14］設計通用引物，正向引物F為5'-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，反向引物R為5'-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，其中正向引物 F含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點，反向引物R含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，預計擴增片段為1 500 bp.PCR反應按照 MESSICK等［15］的方法進行，反應體系的總體積為50μL(2×PCR TaqMix 10μL(0.2 U Taq DNA Polymerase·μL-1;400 μmol·L-1dNTP each;20 mmoL·L-1Tris-HCl，pH 8.7;100 mmol·L-1KCl;3 mmol·L-1MgCl2);正向、反向引物(20μmol·L-1)各 1μL;模板 DNA 5 μL，最后補充雙蒸去離子水至50μL).擴增程序如下:95℃預變性5 min;94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 2 min，再行35個循環(huán);最后于72℃延伸10 min.用蒸餾水作為陰性對照.取10μL PCR產物，經瓊脂糖凝膠電泳后用DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa)回收目的片段.

16SrRNA擴增產物用pTG19-T載體連接，轉化E.coli DH5α后，由北京博尚生物技術有限公司進行測序，測定的DNA序列以雙鏈堿基互補的結果為準.測得的分離株16S rRNA序列在NCBI上進行BLAST后，并同時與3株標準株和GenBank中已登陸的相關菌株的16S rRNA基因序列進行同源性比較，采用基因分析軟件DNAStar Version 5.0中的MegAlign進行同源性比較并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹.

1.7 仔豬的感染試驗

試驗仔豬購自鄭州市某規(guī)?；i場20日齡的6頭健康仔豬，購回后隨機分成2組，分別用于HE43的攻毒和對照試驗.所有仔豬按要求進行飼養(yǎng)，經觀察正常后進行試驗.HE43分離株首先接種兔鮮血平板，37℃ 24 h培養(yǎng)后，4℃條件下離心制成5×1010CFU·mL-1的菌液，用滅菌生理鹽水稀釋成1×1010CFU·mL-1的菌液后，每只仔豬耳靜脈注射3 mL，對照組注射3 mL的滅菌生理鹽水.

2 結果與分析

2.1 細菌特性及生化鑒定結果

分離株為卵圓形、G+，單個、成對或鏈狀排列.關節(jié)液直接涂片鏡檢可見分離株形態(tài)較小，鏈較長，可達20～30個;分離株在BHIA瓊脂平板上生長良好，37℃培養(yǎng)24 h即能長出灰白色、不透明、圓形、微凸、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的露珠狀小菌落;分離株在3%的明膠瓊脂平板上35℃ 24 h培養(yǎng)，菌落周圍均可以形成清楚的暈環(huán).在兔血瓊脂平板上，分離株呈現(xiàn)α型溶血.經Vitek-32全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定為糞腸球菌(E.faecalis)，具體生化試驗結果見表1.

表1 分離株的Vitek-32全自動生化鑒定結果Table1 The biochemical properties of the isolates identified by Vitek-32 automated system

2.2 藥敏試驗

分離株的藥物敏感試驗結果見表2.分離株對包括萬古霉素和替考拉寧在內的13種藥物敏感，但對包括四環(huán)素、紅霉素和卡那霉素在內的7種藥物產生了耐藥性.慶大霉素和鏈霉素高水平耐藥現(xiàn)象雖未出現(xiàn)，但分離株對鏈霉素藥物敏感性為中等.

表2 藥敏試驗結果Table2 The results of drug sensitivity test

2.3 分離株16Sr RNA擴增和酶切鑒定

分離株及3株糞腸球菌標準菌株16S rRNA基因PCR擴增及酶切鑒定結果見圖1和圖2.從圖1中可以看出分離株及3株標準菌株DNA均擴增到1 500 bp左右的16SrRNA基因片段，與預期片段大小相符。圖2中顯示的是重組質粒BamHⅠ結果.

2.4 同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

分離株16S rRNA序列在GenBank中進行BLAST，結果分離株與3株標準菌株和GenBank中登陸的糞腸球菌的16S rRNA序列同源性均在99.5% ～100%，提取GenBank中部分糞腸球菌及與糞腸球菌生化分群在一群的相關腸球菌和3株糞腸球菌標準菌株16S rRNA基因序列與分離株構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，可見分離株與GenBank中糞腸球菌和3株標準菌株同在1個分枝中.

2.5 仔豬的感染試驗

仔豬接種后，有1頭豬于第6天開始出現(xiàn)食欲減少，精神沉郁，呼吸困難，體溫高達40.5～41℃，站立不穩(wěn)，左后側跗關節(jié)處手感稍熱，其他豬隨后也出現(xiàn)相同癥狀.至發(fā)病后第4天，未見試驗豬死亡，隨機將1頭試驗豬剖檢，可見肝、腎、脾及淋巴結腫大、出血，左后側跗關節(jié)有多量稀薄滲出液.從剖檢豬關節(jié)滲出液和各實質臟器中均分離到了與接種菌一致的細菌.

圖3 16S r RNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S r RNA sequence

3 小結與討論

1)從送檢病豬的腫大的關節(jié)液中分離的1株菌株通過細菌涂片染色鏡檢、培養(yǎng)特性和耐性實驗結果，均符合腸球菌的生理特征［16］，經過Vitek-32生化試驗鑒定和16S rRNA基因序列分析證實該起仔豬關節(jié)炎是由糞腸球菌(E.faecalis)引起的.

2)16SrRNA基因序列已被用作分子鐘來評估細菌間的相關性及鑒定未知細菌到屬和種水平的手段［17］，本次測定的分離株的16SrRNA基因序列在NCBI上進行BLAST，其與NCBI上登載的糞腸球菌16SrRNA的序列同源性均在99%以上，其中分離株與3株標準菌株以及與GenBank中的糞腸球菌序列同源性均在99.5% ～100%.但在生化試驗中，分離株與以前從感染豬內臟中分離的其他糞腸球菌對棉子糖、蔗糖、松三糖、乳糖和淀粉等反應結果不完全一致［18］.

3)腸球菌具有天然耐藥和獲得性耐藥的能力，其對外界環(huán)境具有的較高抵抗能力和對藥物的耐藥性能力使其獲得了在各種環(huán)境中較高的生存能力［19］.根據對21種臨床藥物的敏感性試驗，分離株對7種藥物產生了耐藥性，但值得注意的是本分離株對同一類藥物的耐藥性也不相同，如對β-內酰胺類青霉素耐藥，但對氨芐青霉素敏感;對四環(huán)素類的四環(huán)素耐藥，但對強力霉素敏感;對氟喹諾酮類的諾氟沙星耐藥，對左氟沙星和丙氟哌酸敏感等.因此，臨床上治療腸球菌感染時一定要進行藥物的敏感性試驗，以確定最佳治療藥物和避免更多的藥物耐受性菌株產生.

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