蔣 凡，黃壽先，張皓磊，蔣細旺

（1.廣西大學 林學院，廣西 南寧530004；2.江漢大學 生命科學院，湖北 武漢430056）

1 引言

體細胞胚的誘導主要有兩種途徑：一是直接由葉片的葉脈及脈間表皮細胞分裂產生（直接類型）：二是首先由莖段脫分化成愈傷組織，然后由這些愈傷組織的某些細胞形成體細胞胚（間接類型）［1］。由葉片的表皮細胞分裂產生體細胞胚，取材容易，誘導體細胞胚的速度快。

直接體細胞胚發(fā)生途徑形成的體胚，發(fā)生頻率高，無畸形胚產生，生長健壯，分化能力強，成苗率高，而且直接體細胞胚的再生植株變異頻率低［2］。直接體細胞胚具有很強的接受外源DNA的能力，是理想的基因轉化感受態(tài)細胞；而且胚性細胞繁殖量大，同步性好，轉化后的胚性細胞可順利發(fā)育成胚狀體及完整的轉基因植株。大量研究表明，直接體細胞胚發(fā)生多是單細胞起源，轉化獲得的轉基因植株嵌合體少［3，4］，因此，植物通過直接體細胞胚發(fā)生形成的體細胞胚可作為理想的遺傳轉化受體體系［5，6］。

蔣細旺等［7］在對地被菊“玉人面”直接體細胞胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，葉片經體細胞胚誘導培養(yǎng)基（MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L）誘導10 d后，發(fā)現(xiàn)有薄層愈傷的出現(xiàn)，轉接到體細胞胚發(fā)育培養(yǎng)基（MS＋KT 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L）中，13d后，發(fā)現(xiàn)有大量淡黃色顆粒突起，同時愈傷量會增多，到15d時發(fā)現(xiàn)有大量芽點出現(xiàn)，到17d時發(fā)現(xiàn)有大量芽出現(xiàn)，到24d時，又有一批球狀顆粒突起，到30d時，能顯著觀察到分化出兩批植株，高度相差約5mm，高度比值約3～4倍。這兩批植株的出現(xiàn)時間相差大約7～10d。而且由上述誘導的體細胞胚再生出的苗容易玻璃化，體細胞胚發(fā)育為芽之前，葉片外植體表面上容易生根，由體細胞胚發(fā)生途徑轉化為器官發(fā)生途徑；薄層愈傷的出現(xiàn)，也會有一部分體細胞胚是間接體細胞胚發(fā)生。

由于3種方式發(fā)生的時間不一致，在遺傳轉化時，農桿菌侵染的最佳時間也會有差異，而使轉化效率低下。目前對地被菊直接體細胞胚發(fā)生中出現(xiàn)器官發(fā)生途徑及間接體細胞胚發(fā)生途徑該如何克服的研究較少。達克東［8］在蘋果離體葉片培養(yǎng)誘導直接體細胞胚胎發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，2，4－D是使外植體產生薄層愈傷組織的原因之一，葉片在含有2，4－D的培養(yǎng)基中處理時間過長是使外植體產生愈傷組織的原因之二，通過縮短胚性細胞誘導時間和減少誘導培養(yǎng)基中蔗糖量來減少葉片直接體細胞胚發(fā)生中的間接體細胞胚發(fā)生的百分率來得到優(yōu)化。而張?。?］通過提高誘導培養(yǎng)基中的蔗糖濃度到（5%～10%），來提高柑桔幼胚的直接體細胞胚的誘導率來得到優(yōu)化。馬國華［10］在木薯嫩葉直接誘導初生體細胞胚胎發(fā)生和芽的形成的研究中，發(fā)現(xiàn)NAA不僅能夠誘導木薯嫩葉產生體細胞胚，而且能夠直接誘導芽的形成，其它幾種生長素類化合物如2，4－D、dicamba或picloram等只能直接誘導體細胞胚胎發(fā)生，所不同的是這種NAA誘導的木薯體細胞胚胎發(fā)生和芽的器官發(fā)生幾乎是同步進行的，但它們之間在形態(tài)上和植株再生的時間及方式上存在較大的差異。

2 材料與方法

“玉人面”‘Yurenmian’（白花）由北京林業(yè)大學陳俊愉院士提供。MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，試驗激素分別為2，4－D（2，4二氯苯氧乙酸）、KT（激動素）、NAA（萘乙酸）。

2.1 無菌苗的獲得和葉片外植體的準備

按蔣細旺等［11］的方法和培養(yǎng)條件獲得無菌苗并繼代。從新增殖（4周左右）的幼苗上切取嫩葉，并去除葉緣切成約0.5cm2的葉片，以近軸面接觸培養(yǎng)基。每培養(yǎng)皿接種25個外植體，重復5次。

2.2 玉人面的誘導培養(yǎng)時間對體細胞胚發(fā)生的影響

按蔣細旺等［7］的方法和培養(yǎng)條件，進行體細胞胚的誘導，即在誘導培養(yǎng)基MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L中，分別誘導培養(yǎng)3d、5d、7d、10d和15d，然后轉入 MS＋KT2.0mg／L＋NAA0.5mg／L中培養(yǎng)。蔗糖濃度為30g／L，瓊脂糖濃度為6g／L，pH 值為6.0，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，日光燈光源，光照（2 000lx）12h·－1。一共培養(yǎng)25d后，計算直接體細胞胚發(fā)生率、平均每外植體分化的體細胞胚數、體細胞胚發(fā)育為芽前的生根率及玻璃化率。

2.3 不同蔗糖濃度對玉人面體細胞胚誘導的影響

外植體先在 MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L中培養(yǎng)5d，其中蔗糖濃度分別為10g／L、30g／L和60g／L；然后分別轉入含10g／L、30g／L、60g／L蔗糖的 MS＋KT 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一共培養(yǎng)25d后，計算直接體細胞胚發(fā)生率、平均每外植體分化的體細胞胚數、體細胞胚發(fā)育為芽前的生根率及玻璃化率。

2.4 激素對體細胞胚誘導的影響

外植體先培養(yǎng)在 MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L中，蔗糖濃度為10g／L，誘導5d后；轉入MS＋KT＋NAA，其中的KT濃度為（0、0.5、1.0、2.0、4.0mg／L），NAA 濃度為（0、0.5mg／L），共20個組合，蔗糖濃度為30g／L。共計培養(yǎng)25d后，計算直接體細胞胚發(fā)生率、平均每外植體分化的體細胞胚數和體細胞胚發(fā)育為芽前的生根率。

2.5 數據統(tǒng)計與分析

所得數據采用SAS軟件進行方差分析與多重比較（LSD法，P＝0.05）。

（1）體細胞胚發(fā)生率（%）＝產生體細胞胚的外植體個數／外植體總數×100%。

（2）平均每外植體體細胞胚發(fā)生個數＝所有外植體產生的體細胞胚個數／外植體總數×100%。

（3）體細胞胚發(fā)育為芽前的生根率＝外植體生根的個數／外植體總數×100%。

3 實驗結果分析

3.1 誘導培養(yǎng)時間對玉人面體細胞胚發(fā)生的研究

體細胞胚發(fā)生率在誘導培養(yǎng)7d時最高，達100%，誘導培養(yǎng)超過7d或少于7d體細胞胚發(fā)生率都會稍降低；每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量在10d達到12.3個，誘導培養(yǎng)超過10d或少于10d每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量不同程度的減少；僅誘導培養(yǎng)3d時體細胞胚發(fā)育為芽前，沒有有根的生成，其它誘導培養(yǎng)時間有不同程度的生根；薄層愈傷量在各個培養(yǎng)時間均有，但程度不同?？梢姴煌T導培養(yǎng)時間對體細胞胚發(fā)生率、每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量、生根率、薄層愈傷量影響均較大（表1）。最終篩選出7d為最優(yōu)誘導培養(yǎng)時間，見圖1。

表1 玉人面的誘導培養(yǎng)時間對體細胞胚發(fā)生的研究

圖1 經過7d誘導培養(yǎng)的玉人面體細胞

3.2 不同蔗糖濃度對玉人面體細胞胚誘導及發(fā)生的調控研究

直接體細胞胚誘導階段，若培養(yǎng)基的蔗糖濃度過高，經誘導后，易出現(xiàn)薄層愈傷，產生間接體細胞胚，體細胞胚萌發(fā)獲得的苗易玻璃化；直接體細胞胚發(fā)生階段，若培養(yǎng)基的蔗糖濃度過高，獲得的苗容易黃化。若直接體細胞胚一直用高濃度的蔗糖，愈傷程度很大，獲得的苗極度畸形，大部分是通過間接體細胞胚獲得的苗。若一直用低濃度的蔗糖，體細胞胚發(fā)生率及每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量很低。可見蔗糖濃度的變化對體細胞胚發(fā)生率、每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量、生根率、薄層愈傷量影響也較大（見表2）。優(yōu)化結果：直接體細胞胚誘導階段用10g／L的蔗糖，體細胞胚發(fā)育階段用30g／L的蔗糖，見圖2。

表2 不同蔗糖濃度對玉人面體細胞胚誘導及發(fā)生的調控研究

圖2 用蔗糖濃液誘導培養(yǎng)的玉人面體細胞

3.3 激素濃度對玉人面體細胞胚發(fā)生的研究

對于加了NAA的培養(yǎng)基，體細胞胚發(fā)生率、每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量及生根率均比沒加NAA的培養(yǎng)基的要高。但加了NAA后，在體細胞胚發(fā)育成植株前易生根，容易走器官發(fā)生途徑。所以在地被菊“玉人面”體細胞胚發(fā)生途徑中，應去掉NAA，在體細胞胚發(fā)生前就不會有根的形成，培養(yǎng)25后，待芽長出后，才有根的形成。在沒加NAA的五種培養(yǎng)基中，KT為2.0時，體細胞胚發(fā)生率及每個外植體體細胞胚發(fā)生的數量均最高。優(yōu)化后的結果：直接體細胞胚發(fā)育培養(yǎng)基應去掉NAA，僅用2.0mg／L的KT的培養(yǎng)基，見圖3。

表3 激素濃度對玉人面體細胞胚發(fā)生的研究

圖3 用激素濃液誘導培養(yǎng)的玉人面體細胞

4 結語

本文研究得到，地被菊“玉人面”的直接體細胞胚誘導最佳時間為7d，誘導7d后轉入去除2，4－D的培養(yǎng)基中進行體細胞胚的發(fā)育。崔凱榮［12］等研究發(fā)現(xiàn)體胚誘導后必須去掉2，4－D。2，4－D的作用具有階段性，在誘導階段通常起促進作用，而在胚狀體分化發(fā)育階段一般起抑制作用。周俊彥［13］等研究也發(fā)現(xiàn)2，4－D對胡蘿卜的體胚前期誘導有利，對后期發(fā)育抑制。2，4－D的階段性抑制作用，目前可從三個水平上得到證實。在生理水平上，Tisserat B［14］等認為2，4－D 可能通過促進乙烯合成而抑制體胚發(fā)育。這種抑制體胚發(fā)育已為胡蘿卜、枸杞、三葉草，芹菜等許多植物體胚發(fā)生所證實［15－16］。在分子水平上，韓碧文［17］等進一步研究發(fā)現(xiàn)，2，4－D通過抑制胚胎發(fā)育基因的程序表達來抑制體細胞胚的后期發(fā)育。在信號轉導水平上，崔凱榮［18］等認為2，4－D是先與細胞內生長素結合蛋白（ABP）作用，然后通過細胞內信號傳遞系統(tǒng)，激活某些基因的表達，產生特異的mRNA，而促進體細胞胚發(fā)生；但是，一段時間后，它又可以抑制這些基因的表達，激活另一些基因的表達，從而防礙體細胞胚的進一步發(fā)育，認為2，4－D對基因表達的調控有時空特異性。本文的研究結果認為，誘導時間低于7d可能是誘導時間不夠，直接體細胞胚發(fā)生相關基因沒有充分誘導表達，而使直接體細胞胚發(fā)生率和每個外植體上直接體細胞胚發(fā)生的數量較低；誘導時間多于7d，在2，4－D的培養(yǎng)基中暴露時間過長，抑制了直接體細胞胚發(fā)育相關基因的程序表達來抑制體細胞胚的后期發(fā)育，進而使直接體細胞胚發(fā)生途徑轉向間接體細胞胚發(fā)生途徑，導致產生薄層愈傷。

蔗糖量的增加會引起外植體愈傷組織量的增加和間接類型體細胞胚發(fā)生，適當減少培養(yǎng)基中蔗糖量有利于葉片直接體細胞胚誘導；在直接體細胞胚發(fā)育的過程中，提高蔗糖濃度，抑制體胚迅速發(fā)育為植株和大量根的生成，促進胚胎的發(fā)育并停留在球形胚期，調控胚胎發(fā)育。培養(yǎng)基中的糖除了提供培養(yǎng)物的碳源以外還起著調節(jié)滲透壓的作用，一般在體胚誘導階段需要較低的蔗糖濃度［19］，而在體胚成熟階段則需要較高的蔗糖濃度［20］。分子水平上，蔗糖如何調控胚胎的發(fā)育，程玉蘭［21］等認為在體胚發(fā)育過程中，蔗糖濃度可導致體胚內源ABA水平的變化，表現(xiàn)為：60S，ABA含量稍微有下降，并趨于穩(wěn)定，胚也逐漸進入靜止狀態(tài)，并停留在晚期子葉胚后，不再繼續(xù)發(fā)育，而在胚根處產生大量的次生胚；對30S，ABA含量緩慢下降，并開始初生根的發(fā)育，但初生根的發(fā)育緩慢；在10S中，其內源ABA含量急劇下降，胚的形態(tài)建成后就迅速開始胚后發(fā)育，子葉胚迅速長成小苗，根長度伸長至胚體的幾倍。顯然：在體胚發(fā)育過程中，高濃度的ABA水平有利于胚性狀態(tài)的維持。本研究也觀察到這一現(xiàn)象。進一步有學者研究，刑更生［22］等認為ABA通常對DNA和RNA的合成有抑制作用，但對某些植物體細胞胚發(fā)生的特異基因表達則起調控作用，抑制體細胞胚過早萌發(fā)。但這種分子調控機制需進一步研究。

本研究在體細胞胚發(fā)育階段去掉NAA后，在體細胞胚發(fā)育成植株前沒有根的生成。有理由認為：NAA不僅能夠誘導葉片產生體細胞胚，而且能夠直接誘導芽的形成。這和馬國華［10］的研究結果相同。

［1］Sharp W R，Sondahl M R，Caldas L S，et a1.The physiology of in vitro asexual embryogenesis［J］.Hort Rev，1980（2）：268～310.

［2］周麗儂，曹 靜，鄺哲師，等.園藝植物體胚發(fā)生及植株再生技術研究［J］.熱帶作物學報，1998，19（2）：15～19.

［3］Shinoyama H，Nomura Y，Tsuchiya T，et al.A simple and efficient method for somatic embryogenesis and plant regeneration from leaves of chrysanthemum［J］.Plant Biotechnology，2004，21（1）：25～33.

［4］Mandal A K A，Datta S K.Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from ray florets of chrysanthemum［J］.Biologia Plantarum，2005，49 （1）：29～33.

［5］洪 波，全 征，李邱華，等.地被菊花Fall Color體細胞胚途徑再生、遺傳轉化及轉基因植株的抗寒性檢測［J］.中國農業(yè)科學，2006，39（7）：1 443～1 450.

［6］Blanc G，Baptiste C，Oliver G，et al.Efficient Agrobacterium tumefaciens－mediated transformation of embryogenic calli and regeneration of Hevea brasiliensis Mull Arg.plants［J］.Plant Cell Rep，2006（24）：724～733.

［7］蔣細旺，陳發(fā)菊，陸 苗，等.地被菊直接體細胞胚發(fā)生研究［J］.北京林業(yè)大學學報，2008，30（2）：65～70.

［8］達克東，張 松，李雅志，等.蘋果離體葉片培養(yǎng)直接體細胞胚胎發(fā)生研究［J］.園藝學報，1996，23（3）：241～245.

［9］張 健，呂柳新.柑桔幼胚培養(yǎng)的直接體細胞胚發(fā)生與植株再生［J］.河南科技大學學報，2006，26（6）：82～84.

［10］馬國華，許秋生，羨蘊蘭.從木薯嫩葉直接誘導初生體細胞胚胎發(fā)生和芽的形成［J］.植物學報，1998，40（6）：503～507.

［11］蔣細旺，劉國鋒，包滿珠.菊花9個品種葉片和莖段快速高效再生體系的建立［J］.華中農業(yè)大學學報，2003，22（2）：162～166.

［12］崔凱榮，邢更生，周公克，等.植物激素對體細胞胚胎發(fā)生的誘導與調節(jié)［J］.遺傳，2000，22（5）：349～354.

［13］周俊彥.植物體細胞在組織培養(yǎng)中產生的胚狀體Ⅱ.影響植物胚狀體發(fā)生和發(fā)育的因素［J］.植物生理學報，1982，8（1）：91～99.

［14］Tisserat B，Murash ige T.Effects of ethephon，ethylene，and 2，4－dich lorophenoxyacetic acid on asexual embryogenesis in vitro［J］.Plant Physiol，1977（60）：437.

［15］Nadel BL，Altman A，Liv M.Regulation of somatic embryogenesis in celery cell suspension 2.Early detection of embryogenic potential and the induction of synch ronized cell cultures［J］.Plant Cell T issue and Organ Culture，1990（20）：119～124.

［16］Parrott WA.A uxin2stimulated somatic embryogenesis from immature cotyledons of white clover［J］.Plant Cell Rep，1991（10）：17～21.

［17］韓碧文，劉淑蘭.植物離體體細胞胚胎發(fā)生［J］.植物生理學通訊，1988（10）：9～15.

［18］崔凱榮，刑更生，劉新民，等，細胞信號傳導與植物體細胞胚發(fā)生［J］.生命科學，2002，14（3）：171～176.

［19］Gupta P K，Grob J A.Somatic embryogenesis in conifers.In：Jain SM，Gupta PK，Newon PJ（eds）.Somatic Embryogenesis in woody Plants［M］.The Netherlands：Kluwer.Academic Publishers，1995.

［20］Hetherington AM，Quatrano RS.Mechanisms of action of abscisic acid at a cellular level［J］.New phytol，1991（119）：9～32.

［21］程玉蘭，黃美娟，刁豐秋，等.蔗糖調控培養(yǎng)對胡蘿卜體細胞胚內源 ABA水平的效應［J］.植物學報，1999，41（7）：761～765.

［22］刑更生，崔凱榮，山 侖，等.植物體細胞胚發(fā)生的分子基礎［J］.遺傳，1999，21（1）：30～34.