石松生陳春美楊衛(wèi)忠王春華王銳金昌丹

rAAV-AsiNOS抑制C6膠質瘤細胞生長的實驗研究☆

石松生*陳春美*楊衛(wèi)忠*王春華*王銳*金昌丹*

目的 探討攜帶誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）反義RNA重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體（rAAV-AsiNOS）對膠質瘤細胞生長增殖的影響以及對iNOS和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等表達的影響。方法 根據C6細胞培養(yǎng)基成分不同分為3組，即空白組［含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液，n＝4］、β-半乳糖苷酶基因（β-galactosidase gene z，lacz）重組腺相關病毒載體（rAAV-LacZ）組（含有rAAV-LacZ的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n＝4）和rAAV-AsiNOS組（含有rAAV-AsiNOS的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n＝4），C6細胞生長曲線；3組同時進行培養(yǎng)1、3、6、12、24 h，應用流式細胞儀（FCM）檢測C6細胞中NT陽性細胞百分比、iNOS和VEGF陽性細胞百分比，應用半定量反轉錄聚合酶鏈式擴增（RT-PCR）分析iNOS和VEGF mRNA表達。結果 一定感染復數的重組病毒載體rAAV-LacZ對C6膠質瘤細胞生長趨勢無明顯影響，而rAAV-AsiNOS重組病毒載體在轉染C6細胞從3d開始出現(xiàn)細胞生長緩慢，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。FCM檢測結果顯示，NT、iNOS和VEGF陽性細胞在空白組和rAAV-LacZ組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6h開始出現(xiàn)NT、iNOS和VEGF陽性細胞百分比下降， NT百分比分別為9.37%± 1.2%，97.3%±0.75%和4.62%±0.53%；iNOS百分比分別為18.42%±2.17%，14.29%±1.44%和 8.31%±1.30%；VEGF百分比分別為7.85%±0.98%，6.32%±0.78%和 5.04%±0.41%，較空白組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；半定量RT-PCR分析結果顯示，同一時間中，iNOS mRNA在空白組和rAAV-LacZ組之間差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6h開始出現(xiàn)iNOS mRNA表達下降，分別為0.46±0.04，0.34±0.03和0.21±0.03，較同一時間空白組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 攜帶iNOS反義RNA腺相關病毒載體rAAV-iNOS能夠抑制C6膠質瘤細胞生長增殖，能夠抑制iNOS表達，從而通過抑制VEGF基因表達發(fā)揮抗膠質瘤細胞生長增殖的重要作用。

膠質瘤iNOS 重組腺相關病毒載體 VEGF 細胞增殖

誘導型一氧化氮合酶（iNOS）廣泛參與了膠質瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過程，與膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［1］。針對iNOS的“靶點治療”，可能是膠質瘤綜合治療的一條新途徑。本實驗在前期成功構建了攜帶iNOS反義RNA的重組腺相關病毒載體（rAAV-AsiNOS）基礎上［2］，探討iNOS反義RNA基因對膠質瘤細胞生長增殖的影響，為膠質瘤治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 研究對象 攜帶iNOS反義RNA的重組腺相關病毒載體（rAAV-AsiNOS）以及攜帶半乳糖苷酶基因（LacZ）的腺相關病毒載體（rAAV-LacZ）由我所成功構建［2］，大鼠膠質瘤 C6細胞購自中國科學院上海生命科學研究院。兔抗鼠的硝基酪氨酸（nucleotide，NT）、iNOS、VEGF單克隆一抗體和FITC標志（標記綠色熒光）的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Trizol試劑盒和RT-PCR kit（二步法）購自 Promega（美國），iNOS引物由上海生物工程公司合成。

1.2 重組腺相關病毒載體對C6細胞生長曲線影響 在24孔板中每孔接種2×103個C6膠質瘤細胞，在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待細胞生長50%左右，棄去培養(yǎng)基后，分別換成含有重組腺相關病毒載體 （rAAV-AsiNOS和rAAV-LacZ）的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加入的重組病毒按感染復數 （multiplicity of infection，MOI）100，分別為rAAV-AsiNOS組和rAAV-LacZ組，設立空白組（即10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液），置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)， 觀察形態(tài)，共3組，每天從每組取4孔細胞，消化，離心后計數 ，連續(xù)觀察7 d，繪制細胞生長曲線。

1.3 rAAV-AsiNOS抑制C6膠質瘤細胞的實驗

1.3.1 實驗分組 在24孔板中每孔接種1×105個C6膠質瘤細胞，在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待細胞生長60%左右，棄去培養(yǎng)基后，分別換成含有重組腺相關病毒載體（rAAV-AsiNOS和rAAV-LacZ）的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加入的重組病毒按MOI 100，設立空白組（即10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液）。置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)1、3、6、12、24 h后，進入下一步實驗。

1.3.2 流式細胞儀（FCM）檢測NT陽性細胞百分比 收集各組不同培養(yǎng)時間的C6膠質瘤細胞，依次加入稀釋好的一抗兔抗鼠的NT單克隆抗體，室溫下共孵育30 min，洗滌、離心。加入二抗FITC標志（標記綠色熒光）的羊抗兔IgG，共孵育30 min，離心、洗滌，上機檢測。定量分析NT陽性細胞熒光強度和NT陽性細胞絕對數，計算NT陽性細胞百分比。NT陽性細胞百分比＝NT陽性細胞絕對數／（NT陽性細胞絕對數 ＋NT陰性細胞絕對數）×100%。

1.3.3 FCM定量檢測iNOS和VEGF陽性細胞百分比 收集各組不同培養(yǎng)時間的C6膠質瘤細胞，依次分別加入兔抗鼠的iNOS、VEGF單克隆一抗體和二抗FITC標志 （標記綠色熒光）的羊抗兔IgG，上機檢測，獨立重復4次實驗，計算陽性細胞百分比。

1.3.4 半定量RT-PCR分析iNOS mRNA 收集各組不同培養(yǎng)時間的C6膠質瘤細胞，用Trizol試劑抽提RNA，計算總RNA濃度，取總RNA 2 μg進行逆轉錄。再以逆轉錄反應液2 μL作為模板，加入相應引物（β-actin內參照）進行PCR擴增，總反應體積50 μL。所用引物分別為iNOS（正義鏈5′-TCGAGCCCTGGAAGACCCACATCT-3′；反義鏈 5′-GTTGTTCTT CTTCCAAGGTGTTTGCCTTAT-3′），β-actin（正義鏈 5′-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3′；反義鏈5′-CAGCACTGTGTTGGCA TAGA 3′）。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸1 min（以上步驟循環(huán)35次），最后72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，美國伯樂BIO-RAD Gel DocTM XR凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相，獨立重復4次實驗，以β-actin內參照作為內標，與同步產物進行比較，對PCR產物相對定量，應用quantity-one分析軟件半定量分析，計算所得產物的積分光密度與各自內參照積分光密度的比值來反映該iNOS mRNA的水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行處理，數據以均數±標準差（±s）表示，3組數據進行方差齊性分析后再進行兩組間比較，采用q檢驗分析，檢測水準α＝0.05。

2 結果

2.1 重組腺相關病毒載體對C6膠質瘤細胞生長影響 與同一時間空白組C6膠質瘤細胞比較，一定感染復數（MOI 100）的rAAV-LacZ重組病毒載體對C6膠質瘤細胞生長趨勢無明顯影響，而rAAV-AsiNOS重組病毒載體在轉染3 d開始出現(xiàn)C6細胞生長緩慢，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 FCM檢測NT陽性細胞百分比 FCM檢測結果顯示，C6膠質瘤細胞在含有重組病毒載體AAV-AsiNOS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h開始，NT陽性細胞百分比較空白組和AAV-LacZ組的明顯下降，并隨著培養(yǎng)時間延長百分比下降，二者之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 FCM定量檢測iNOS、VEGF和PCNA陽性細胞百分比

定量FCM檢測結果顯示，空白組和rAAV-LacZ組之間iNOS陽性細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6 h開始出現(xiàn)iNOS陽性細胞百分比下降，較空白組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

VEGF陽性細胞空白組和rAAV-LacZ組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6 h開始出現(xiàn)iNOS陽性細胞百分比下降，較空白組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表4）。

2.4 半定量RT-PCR分析iNOS mRNA基因表達水平 所有組別提取的總 RNA的λ值（OD260／OD280）在 1.86至1.97之間，說明總RNA濃度合適，總RNA在2.0%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示均可見三條帶，表明所提取的RNA未見降解。半定量PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果表明，iNOS和β-actin mRNA的特異性片段大小分別為276 bp和201 bp。iNOS mRNA在不同組別中均有不同程度表達，其中，同一時間空白組和rAAVLacZ組之間差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6 h開始出現(xiàn)iNOS mRNA表達下降，與空白組同一時間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表5，圖1～3）。

3 討論

本課題組在實驗前期工作中已經成功地構建了攜帶iNOS反義RNA基因片斷重組腺相關病毒載體（rAAV-AsiNOS）并引入腺相關病毒載體rAAV-LacZ作為對照載體，成功地應用于研究iNOS在腦缺血發(fā)病機制作用研究［3］。本實驗將這種重組腺相關病毒載體轉染C6膠質瘤細胞，與空白組比較，發(fā)現(xiàn)一定感染復數的重組病毒載體rAAV-LacZ對C6膠質瘤細胞生長并未產生明顯的影響，而轉染重組病毒載rAAV-Asi-NOS后C6膠質瘤細胞生長緩慢，說明攜帶iNOS反義RNA基因片斷重組載體能夠抑制膠質瘤細胞生長增殖。

將攜帶正義或反義目的基因片斷重組病毒載體轉染到靶細胞中，使目的基因在靶細胞中表達特定的功能，或目的基因片斷抑制靶細胞特異性基因表達，這就是當前基因治療的重點研究方向之一［4］。本實驗中，將 iNOS基因片斷反向克隆到腺相關病毒載體中，構建攜帶iNOS反義RNA腺相關病毒載體，并將重組載體轉染到C6膠質瘤細胞中，抑制C6膠質瘤細胞中iNOS的表達，減少iNOS介導促進腫瘤細胞生長增殖的作用。

表1 C6膠質瘤細胞在不同組別中不同培養(yǎng)時間的細胞數［（±s）×103，n＝4］

表1 C6膠質瘤細胞在不同組別中不同培養(yǎng)時間的細胞數［（±s）×103，n＝4］

1）經q檢驗分析，與空白組比較，P＜0.05

組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 d 2.00±0.00 2.00±0.00 2.00±0.00 2 d 2.74±0.70 2.84±0.83 2.79±0.50 3 d 4.71±0.23 4.54±0.17 4.02±0.761）4 d 7.41±0.25 7.32±0.36 6.11±0.201）5 d 10.77±2.07 10.24±1.28 8.50±0.861）6 d 13.31±2.17 12.97±2.01 9.30±0.491）7 d 19.18±2.24 18.61±2.00 11.34±1.451）

表2 NT陽性細胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

表2 NT陽性細胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

1）經q檢驗分析，與空白組比較，P＜0.05

NT陽性細胞百分比組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 12.23%±1.22% 11.44%±1.29% 12.29%±1.98% 3 h 13.96%±1.09% 12.97%±1.14% 12.86%±1.00% 6 h 14.26%±2.08% 13.23%±1.25% 9.33%±1.39%1）12 h 14.16%±0.84% 15.05%±1.02% 7.34%±0.72%1）24 h 15.79%±0.95% 14.99%±0.78% 4.57%±0.58%1）

表3 iNOS陽性細胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

表3 iNOS陽性細胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

1）經q檢驗分析，與空白組比較，P＜0.05

iNOS陽性細胞百分比組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 23.40%±1.01% 24.13%±1.22% 23.68%±1.05% 3 h 24.32%±1.24% 23.93%±1.47% 22.27%±2.24% 6 h 24.6%±0.81% 24.32%±1.52% 18.54%±3.66%1）12 h 24.14%±1.14% 23.91%±0.76% 14.67%±0.78%1）24 h 25.17%±1.17% 24.44%±1.25% 8.30%±1.28%1）

表4 VEGF陽性細胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

表4 VEGF陽性細胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

1）經q檢驗分析，與空白組比較，P＜0.05

VEGF陽性細胞百分比組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 11.36%±1.02% 11.04%±1.41% 10.74%±0.91% 3 h 11.45%±1.05% 11.98%±1.25% 10.71%±1.00% 6 h 10.49%±0.68% 11.38%±1.94% 7.32%±1.74%1）12 h 11.64%±2.33% 12.37%±1.13% 6.38%±1.47%1）24 h 12.56%±0.86% 11.80%±1.24% 5.11%±1.10%1）

表5 iNOS mRNA相對值在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

表5 iNOS mRNA相對值在不同組別不同培養(yǎng)時間的變化［±s，n＝4］

1）經q檢驗分析，與空白組比較，P＜0.05

iNOS mRNA相對值組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 0.56%±0.12% 0.53%±0.15% 0.51%±0.09% 3 h 0.59%±0.12% 0.56%±0.05% 0.52%±0.10% 6 h 0.62%±0.09% 0.59%±0.11% 0.46%±0.14%1）12 h 0.61%±0.11% 0.56%±0.11% 0.34%±0.06%1）24 h 0.61%±0.12% 0.57%±0.16% 0.21%±0.03%1）

圖1 空白組不同培養(yǎng)時間的iNOS mRNA表達

圖2 rAAV-LacZ組不同培養(yǎng)時間的iNOS mRNA表達

圖3 rAAV-AsiNOS組不同培養(yǎng)時間的iNOS mRNA表達

iNOS是合成一氧化氮（NO）關鍵酶，參與腫瘤新生血管生成以及擴張血管等途徑促進腫瘤細胞增殖，惡性腫瘤細胞產生的NO在增加腫瘤血供和促進腫瘤血管生成等方面發(fā)揮作用，iNOS和VEGF基因均參與人腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程，而且與膠質瘤惡性度相關［5］。NO在體內可與超氧陰離子（superoxide O2－）快速結合生成過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite，ONOO－），NT是ONOO－在體內生成的特異性標記物［6］，在整體內NT的生成和定位可反映ONOO－的產生狀態(tài)與分布，NT陽性細胞百分比能夠間接反映體內NO的含量。本實驗中，F(xiàn)CM檢測結果顯示，重組病毒載體rAAV-AsiNOS轉染C6膠質瘤細胞6 h后，iNOS陽性細胞比、NT陽性細胞比和VEGF陽性細胞比均出現(xiàn)不同程度下降，說明攜帶iNOS反義基因的重組病毒載體能夠抑制膠質瘤C6細胞iNOS表達，減少NO合成，出現(xiàn)NT陽性細胞比例下降，影響了VEGF表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。然后，重組病毒載體rAAV-LacZ并不能影響iNOS在C6細胞中的表達，NT陽性細胞比和VEGF陽性細胞比與空白組相仿。

iNOS和VEGF參與體外C6膠質瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程，其主要機制可能是各種細胞因子激活了iNOS，后者催化合成NO，調控細胞營養(yǎng)成分和促進細胞生長增殖。將iNOS反義RNA基因轉染到C6膠質瘤細胞腫瘤，能夠抑制iNOS基因的表達，減少NO合成和VEGF基因表達，抑制腫瘤血管生成，從而達到抗膠質瘤細胞生長增殖作用，也進一步證實iNOS和VEGF之間的相關性，可能共同參與調控膠質瘤生長增殖過程。

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［3］ 楊衛(wèi)忠，陳春美，王春華，等.NOS反義RNA重組腺相關病毒載體體內提高腦細胞耐缺血能力的實驗研究［J］.中國神經精神疾病雜志，2008，34（5）291－295.

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（責任編輯：甘章平）

R743.33

A

2011－01－14）

☆ 福建省教育廳科技計劃項目資助（編號：JA05259）

* 福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院神經外科 福建省神經外科研究所（福州 350001）