呂冬霞,杜 偉,范曉艷,張曉波

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,黑龍江佳木斯 154007)

細(xì)胞凋亡作為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究中最引人注目的領(lǐng)域之一,正以驚人的速度取得令人矚目的進(jìn)展。研究顯示灰樹花多糖可減少化學(xué)療法的副作用。順鉑是目前應(yīng)用最廣泛的化療藥物之一,本研究通過測定腫瘤抑制率、HE染色和免疫組化檢測Caspase-3的表達(dá),探討灰樹花多糖聯(lián)合順鉑對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

瘤株:H22肝癌細(xì)胞購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動物中心;實(shí)驗(yàn)動物:昆明種近交系小鼠,體重(20±2.0)g,雄性,佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,許可證號:黑動字第99101001,普通級,普通環(huán)境飼養(yǎng)?；覙浠ǘ嗵欠勰?浙江方格藥業(yè)有限公司,多糖含量90%)。順鉑粉劑(山東齊魯制藥廠)。Caspase-3抗體(河北博海生物)。SP-9001試劑盒(北京中杉金橋)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型的建立、分組與給藥方式

40只昆明種小鼠各自接種1×107/mL細(xì)胞懸液于右側(cè)腋下,隨機(jī)分成4組,每組10只。24h,開始給藥。給藥時間為:每日早上進(jìn)行灌胃一次,晚上進(jìn)行腹腔注射一次,間隔時間12h,連續(xù)給藥14d。具體給藥方法見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動物的給藥種類與用量

1.2.2 腫瘤抑制率

腫瘤抑制率(%)=(陰性組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/陰性組平均瘤重×100%。

1.2.3 HE染色

按說明書操作。

1.2.4 免疫組化

采用SP法。Caspase-3陽性為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿著色。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用完全隨機(jī)設(shè)計兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)和方差分析,P＜0.05為有差異。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤抑制率

表2 腫瘤抑制率(± s,n=10)

表2 腫瘤抑制率(± s,n=10)

注:與陰性組比較 * P＜0.05,**P＜0.01。

平均瘤重(g)___________腫瘤抑制率(%)陰性組 2.57±0.54 —灰樹花多糖組 1.58±0.31* 38.52順鉑組 1.08±0.12* 57.98聯(lián)合組 0.86±0.07** 66.54_______

2.2 HE染色

HE染色后在高倍鏡下觀察:陰性組的H22腫瘤細(xì)胞大小和形態(tài)很不一致,呈多形性,棱形或多邊形鋪層生長,可觀察到瘤巨細(xì)胞。細(xì)胞核的體積增大,核質(zhì)比增高。出現(xiàn)巨核、雙核、多核或奇異形核。核仁明顯,體積大,數(shù)目增多,核分裂相增多,出現(xiàn)異常的核分裂相;各給藥治療組的H22腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞間接觸的消失,但細(xì)胞膜依然完整。染色質(zhì)固縮,形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài),沿著核膜分布?？梢姷蛲鲂◇w的形成。

2.3 免疫組化

對免疫組化的片子進(jìn)行顯微鏡觀察,caspase-3為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿著色。采用免疫組化評分法,由2名觀察者對切片盲式閱片,顯微鏡下隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野(×400),觀察所選擇視野中的所有細(xì)胞,記錄陽性染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并計分。評分標(biāo)準(zhǔn)如下:

A為陽性細(xì)胞數(shù)分級0～1%=0;1%～10%=1;10%～50%=2;50%～80%=3;80%～100%=4。

B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級 0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)。

IHS=A×B

對所得數(shù)值進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)。

表3 小鼠實(shí)體瘤caspase-3表達(dá)(± s,n=10)

表3 小鼠實(shí)體瘤caspase-3表達(dá)(± s,n=10)

注:與對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01。

_級別 caspase-3陰性組 0.5556±0.0182灰樹花多糖組 1.0000±0.2042*順鉑組 1.8889±0.2936**_聯(lián)合組 3.3333±0.6933*________________*

3 討論

灰樹花多糖是從灰樹花子實(shí)體、菌絲體中提取的,具有增強(qiáng)免疫功能、抑制腫瘤、抗HIV病毒、穩(wěn)定血壓、降低血糖、改善脂肪代謝等廣泛的生理活性[1]。有研究表明,PGF對體內(nèi)S180肉瘤具有抑制作用[2]。通過HE染色在光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài),陰性組的H22腫瘤細(xì)胞呈棱形或多邊形鋪層生長,細(xì)胞分裂增殖活躍,多見分裂相;各給藥組的H22腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡特征,說明順鉑和灰樹花多糖均可誘導(dǎo)H22腫瘤細(xì)胞凋亡。Caspase被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的核心執(zhí)行者即凋亡的共同通路。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路且位于該細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)的下游,它通過下游效應(yīng)因子切斷細(xì)胞間的信號傳遞,重組細(xì)胞骨架,關(guān)閉DNA復(fù)制和修復(fù),破壞DNA和細(xì)胞核結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)凋亡小體來執(zhí)行凋亡功能[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明灰樹花聯(lián)合順鉑抑制腫瘤生長與促進(jìn)Caspase-3高表達(dá)有關(guān)。通過本實(shí)驗(yàn)觀察到,灰樹花多糖組、順鉑組、聯(lián)合組均對H22細(xì)胞具有殺傷作用,以聯(lián)合組效果最明顯。各治療組均對腫瘤細(xì)胞有抑制作用,聯(lián)合組最強(qiáng),其次為順鉑組,再次為灰樹花多糖組。聯(lián)合組抑瘤效果最佳,且小鼠生命力旺盛,說明灰樹花多糖對于順鉑有增敏作用,且明顯。

本研究提示順鉑、灰樹花多糖可以有效地抑制 H22腫瘤細(xì)胞的增殖,從而導(dǎo)致 H22腫瘤細(xì)胞大量凋亡。應(yīng)用灰樹花多糖聯(lián)合順鉑具有一定的協(xié)同作用,在降低化療藥物毒副作用的同時有效誘導(dǎo)H22腫瘤細(xì)胞凋亡,提高綜合治療效果。綜合考慮灰樹花多糖的多種功效和高安全性,它具有可能成為腫瘤化療輔助劑的巨大潛力。

[1]Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential[J].Altern Med Rev,2001,6(1):48-60

[2]杜景衛(wèi),夏作理,李清初,等.灰樹花多糖抗S180肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,25(2):193-195

[3]Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases[J].Trends Biochem Sci,1997,22(8):299-306