何 敏,盧思廣

(1.徐州醫(yī)學(xué)院,江蘇徐州 221002;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港第一人民醫(yī)院兒科,江蘇連云港 222000)

30多年前,研究者發(fā)現(xiàn)了大量具有解除特異抗原的免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞。在1975年,這些細(xì)胞被命名為抑制細(xì)胞,即目前的 T reg細(xì)胞,它可抑制器官移植的排斥反應(yīng)[1]。Treg細(xì)胞表面高表達(dá)CD25,而胞內(nèi)Foxp3基因是其一個(gè)相對(duì)特異標(biāo)志和功能分子,高表達(dá)Foxp3基因的Treg細(xì)胞對(duì)于維持免疫系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和預(yù)防自身免疫疾病有極其重要的作用[2]。而Foxp3基因的穩(wěn)定表達(dá)可通過(guò)表觀修飾方式調(diào)節(jié),如組蛋白及DNA修飾。在Treg細(xì)胞中,foxp3啟動(dòng)子區(qū)的CPG模體幾乎完全去甲基化,顯示穩(wěn)定的Foxp3的表達(dá),而CD4+CD25-T細(xì)胞正好相反[3,4]。目前,5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2dc)是研究最多的去甲基化藥物,它能夠逆轉(zhuǎn)基因的甲基化狀態(tài),從而恢復(fù)基因的表達(dá)水平。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)組蛋白去乙酰化抑制酶試劑(如TSA)通過(guò)表觀修飾研究較多,但使用DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-2dc誘導(dǎo)Treg細(xì)胞研究較少,特別是這種藥物對(duì)Treg細(xì)胞表型維持的研究。本研究中,用5-Aza-2dc試劑使DNA去甲基化,促進(jìn)特異基因Foxp3的表達(dá),并可使CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞,從而為穩(wěn)定與預(yù)防自身免疫疾病提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

PHA(美國(guó)Sigma);人Treg分選試劑盒和MACS分選器(德國(guó)Miltenyi);MTT試劑(美國(guó)Sigma);5-Aza-2d(美國(guó)Sigma);人淋巴細(xì)胞分離液(加拿大Cedarlane);酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 PHA最佳濃度的摸索

用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度至 1×106/mL,并加入不同終濃度PHA(0μ g/mL、μ g/mL、7.5μ g/mL 、10μ g/mL 、12.5μ g/mL),每個(gè)濃度設(shè)置 5個(gè)復(fù)孔,置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 68h,然后加入 MT T繼續(xù)培養(yǎng) 0h、2h、4h、6h,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的顯色,分別上酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm,參考波長(zhǎng)650nm,檢測(cè)各孔細(xì)胞光密度值(OD值),確定最佳的檢測(cè)時(shí)間和刺激濃度。

1.2.2 CD4+CD25+T細(xì)胞的分離及純度鑒定

采集100mL新鮮外周血(自愿獻(xiàn)血的健康人)使用Fillcon密度梯度離心法分離人 PBMC,參照美天旎 CD4+CD25+T reg細(xì)胞的免疫磁珠分選試劑盒說(shuō)明書(shū),獲得陰選CD4+CD25-T細(xì)胞,陽(yáng)選CD4+CD25+T reg細(xì)胞(即 nT-reg)。分別取少量分選所得細(xì)胞,加入抗CD4/抗CD25熒光抗體,避光孵育15min,PBS緩沖液洗滌一次,加PBS重懸,然后上流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)純度。

1.2.3 分選細(xì)胞活性及計(jì)數(shù)檢測(cè)

利用臺(tái)盼藍(lán)染色法評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞活性,取0.1mL細(xì)胞懸液,加等量的0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液,充分混勻,染色2min。取上述細(xì)胞懸液少許滴在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹足曹處流出懸液,至蓋玻片被液體充滿為止。置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)其中藍(lán)染的細(xì)胞。結(jié)果顯示正常細(xì)胞不著色,死細(xì)胞被染成藍(lán)色。細(xì)胞活力及密度按下列公式計(jì)算:細(xì)胞活力(%)=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))÷總細(xì)胞數(shù)×100%;細(xì)胞密度=(4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104/mL

1.2.4 制備抗原提呈細(xì)胞

使用含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整部分CD4+CD25-T細(xì)胞密度至 1×107/mL,加入終濃度25μ g/mL的絲裂霉素 C,置 37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)30min,使用RPMI 1640清洗 3次,并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL備用。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理

使用SPSS v13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,各組計(jì)量資料以(± s)表示,各組進(jìn)行比較前先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫磁珠分選的結(jié)果

分選前PBM C活力為(95.63±1.80)%,分選后 CD4+CD25-T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞活力分別為(95.70±1.50)%和(93.60±2.16)%,分選前后細(xì)胞活力比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

2.2 不同濃度5-Aza-2dc對(duì)Naive T細(xì)胞的誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)中我們把三種不同濃度5-Aza-2dc處理后,Naive T細(xì)胞受到不同程度的誘導(dǎo),且濃度在 100μ g時(shí),誘導(dǎo)率最高。見(jiàn)表1。

2.3 在不同處理時(shí)間下,對(duì)Naive T細(xì)胞的誘導(dǎo)

根據(jù)上述結(jié)果,在5-Aza-2dc濃度為100ng/mL時(shí),使用不同時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜標(biāo)志CD25的表達(dá)。結(jié)果顯示,藥物處理后72h,Treg細(xì)胞比例最大。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度5-Aza-2dc對(duì)Naive T細(xì)胞的影響(n=5)

表2 5-Aza-2dc不同處理時(shí)間下對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)的影響(n=5)

3 討論

Treg細(xì)胞在體內(nèi)僅占外周CD4+T細(xì)胞的5%～10%,絕對(duì)數(shù)量極少,在抗原的刺激下,自身又很難擴(kuò)增和增殖,因此,本實(shí)驗(yàn)選擇Naive T細(xì)胞作為研究對(duì)象,此類細(xì)胞并非終末期細(xì)胞,通過(guò)不同藥物誘導(dǎo)分化這類細(xì)胞成目的細(xì)胞。5-Aza-2dc作為一種嘧啶核苷類似物,在DNA復(fù)制過(guò)程中與甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)結(jié)合形成一種共價(jià)復(fù)合物,抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性,從而達(dá)到去甲基化,使多種因甲基化而失活的基因重新表達(dá),恢復(fù)基因的功能,促使細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在本研究中,該藥物可以促使Naive T細(xì)胞內(nèi)的Foxp3基因重新表達(dá),而Foxp3基因是T reg細(xì)胞的相對(duì)特異的標(biāo)志和功能分子,故可誘導(dǎo)Naive T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞,研究結(jié)果顯示,在培養(yǎng)第24小時(shí)后,T reg細(xì)胞數(shù)明顯上升,72h膜標(biāo)志CD25含量最高,而接下來(lái)的繼續(xù)培養(yǎng)中或撤離藥物,隨著時(shí)間延長(zhǎng),Treg細(xì)胞的比例逐漸減少,因此,5-Aza-2dc只能短暫地維持細(xì)胞的表型穩(wěn)定。如能成功實(shí)現(xiàn)對(duì)Treg細(xì)胞表型的長(zhǎng)期穩(wěn)定,將可上調(diào)細(xì)胞的數(shù)量和功能,達(dá)到治療自身免疫性疾病的作用。

[1]Kilshaw PJ,Brent L,Pinto M.Suppressor T cells in mice made unresponsive to skin allografts[J].Nature,1975,255:489

[2]Brunkow M E,Jeffery EW,Hjerrild KA,et al.Disruption of a new foxk-head/helix protein,scurfin,results in the fatal lymphoproliferactive disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27(1):68-73

[3]Janson PC,Winerdal M E,Marits P,et al.FOXP3 promoter demethy lation reveals the committed Treg population in humans[J].P LoS one,2008,3(2):1612

[4]Zinner R,Albiezl H,Walter J,et al.Histone lysine methylation patterns in human cell types are arranged in distinct three dimensional nuclear zones[J].Histochem Cell Biol,2006,125(1-2):3-19