谷志龍,楊福義,楊衛(wèi)東,張 瑤

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江佳木斯 154003)

血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,能造成血腦屏障的變化,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的水腫、變性壞死等病理變化[1],嚴(yán)重影響患者的預(yù)后,乃至死亡。S100b含量與血管痙攣的發(fā)生密切相關(guān)。但以往的研究?jī)H停留在檢測(cè)血漿及腦脊液中S100b濃度的水平,本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR法對(duì)S100b基因進(jìn)行檢測(cè),并利用Western-blot技術(shù)對(duì)大鼠基底動(dòng)脈組織中的S100b蛋白進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步的探討S100b基因表達(dá)水平和血管痙攣的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

4%多聚甲醛、10%水合三氯乙醛、RT-PCR試劑盒、DEPC 、Trizol液、引物(大連寶生物)和DNA marker。兔抗大鼠S100b抗體(SANTA CRUZ),辣根酶標(biāo)記羊抗兔二抗(中杉金橋),內(nèi)參β-actin,蛋白質(zhì)marker,PVDF膜(碧云天)。大鼠S100b基因片段擴(kuò)增的引物序列,上游5'-GCCCTCATTGATGTCTTCC-3';下游 3'-TCCTTTAGT TTCTCGTCCTTC-5',擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為 130bp;βactin基因片段擴(kuò)增的引物序列,上游 5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3';下游 3'-GCAACTGTAGGCATTTCTGG-5',擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為 652bp。電泳儀、PCR儀、DU-800蛋白核酸分析儀、PAGE凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀、聯(lián)科發(fā)光試劑盒等。

1.2 方法

①將Wistar大鼠腹腔麻醉,備皮消毒。斷尾取血 0.3mL,經(jīng)環(huán)枕膜垂直進(jìn)針2.5mm后緩慢注入枕大池,注血速度控制在0.lmL/min以內(nèi),縫合切口,消毒。假手術(shù)組,用等量的生理鹽水做相同處理。術(shù)后大鼠盡量保持頭低俯臥位為0.lmL/min,縫合切口,消毒。

②3d后斷髓處死大鼠,通過后頸部取出含有腦干的基底動(dòng)脈,一部分放置在液氮中保存,用于基因和蛋白的檢測(cè),另一部分放置在多聚甲醛中固定1d。經(jīng)過固定、浸潤(rùn)、脫水、透明后包埋,每組各標(biāo)本均切4張,厚度為 7μ m,進(jìn)行 HE染色。

③基底動(dòng)脈組織一部分用于組織勻漿的制備;一部分立即放入液氮速凍后,在-80℃保存?zhèn)溆?。取基底?dòng)脈組織100mg于無菌勻漿器中,加冰生理鹽水1mL,置于冰上勻漿。離心后,取上清液制成1%的組織勻漿。S100b基因的表達(dá):RT-PCR法。大鼠基底動(dòng)脈組織RNA,測(cè)280nm/260nm OD值后即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,TB染色,凝膠成像儀成像后用Tannon Gis軟件分析?；讋?dòng)脈組織中 S100b蛋白的表達(dá):Western Blot法檢測(cè)檢。提取大鼠基底動(dòng)脈組織總蛋白,檢測(cè)蛋白含量:采用BCA法,通過PAGE凝膠電泳分離蛋白,各孔上樣體積20μ L,電泳約1.5h后取膠,根據(jù)M arker,切取10KD大小蛋白位置的膠,半干法在轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)膜,100mA流,60min。轉(zhuǎn)膜后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1.5h,經(jīng)過一抗孵育,4℃冰箱過夜,取出后用TBST洗滌3次,各 10min,二抗室溫孵育1.5h后,TBST洗滌3次,各10min,ECL發(fā)光液顯色,曝光,通過Tannon Gis軟件分析,測(cè)光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)HE染色鏡下觀察

大鼠基底動(dòng)脈經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組,生理鹽水組可見動(dòng)脈內(nèi)膜完整,內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密;手術(shù)組出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞褶皺、變性,平滑肌細(xì)胞肥大,可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且管腔直徑明顯小于正常對(duì)照組和生理鹽水組,見圖1。

2.2 各組大鼠基底動(dòng)脈中S100B基因及蛋白表達(dá)情況

S100b mRNA及蛋白在對(duì)照組和假手術(shù)組中均有微量表達(dá),且差異不顯著(P＞0.05);與假手術(shù)組相比,手術(shù)組表達(dá)明顯(P＜0.01)。

圖1 Wistar大鼠基底動(dòng)脈觀察(HE×200)

表1 S100b基因及蛋白在基底動(dòng)脈中的表達(dá)分析結(jié)果(± s)

表1 S100b基因及蛋白在基底動(dòng)脈中的表達(dá)分析結(jié)果(± s)

注※與對(duì)照組比較,P＞0.05;# 與假手術(shù)組比較,P＜0.01。

_組別 n S100b/β-actin(mRNA) S100b/β-actin(Protein)對(duì)照組 10 0.037±0.043 0.2092±0.0626 0.0243±0.0530 0.1792±0.0734假手術(shù)組 10 0.051±0.0471※ 0.3602±0.0822 0.0683±0.06811# 0.2461±0.0836_手術(shù)組 8 0.303±0.0812※ 0.8709±0.0751_________________0.5291±0.094_______________________________62#_0.8479±0.0829

圖2 S100b mRNA RT-PCR后電泳圖

3 討論

S100b蛋白是Moore等[2]人在1965年首先在牛的腦組織發(fā)現(xiàn)的,此種蛋白能完全溶解在中性飽和硫酸銨中而因此得名。高濃度的S100b具有神經(jīng)毒性,濃度大小與腦血管疾病,顱腦外傷及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)S100b基因表達(dá)與蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣密切相關(guān)。

目前蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹苽渲饕?穿刺法[3]是阻斷頸總動(dòng)脈后通過頸總動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈并刺破分叉處制作而成,手術(shù)成熟,簡(jiǎn)單,無需開顱,但手術(shù)過程中易造成短暫性腦缺血,誘發(fā)腦梗塞,術(shù)后動(dòng)物死亡率高;血管撕裂法,穿刺法以及注血法。血管撕裂法主要是撕裂大腦中主要大動(dòng)脈來模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血,該方法的出血時(shí)間,出血速度,出血量不易被控制,且模型制備過程中破損了蛛網(wǎng)膜的完整性,導(dǎo)致硬膜下血腫;而注血法[4]無需破壞動(dòng)脈壁,通過腦池如枕大池,視交叉池,將血液直接注入蛛網(wǎng)膜下腔,該方法具有操作簡(jiǎn)單、直接、重復(fù)性高,出血量可控制的優(yōu)點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)利用枕大池注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,通過術(shù)后3d對(duì)大鼠基底動(dòng)脈進(jìn)行HE染色,鏡下發(fā)現(xiàn)血管管腔狹窄、內(nèi)皮細(xì)胞變性、平滑肌細(xì)胞肥大,同時(shí)伴有外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的病理變化。S100b是一種酸性鈣結(jié)合蛋白,廣泛存在于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的星型角質(zhì)細(xì)胞中,正常體內(nèi)含微量S100b蛋白,通過和鈣離子結(jié)合,激活腦果糖1,6-2磷酸醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶,進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝,對(duì)神經(jīng)的生長(zhǎng)和修復(fù)起到促進(jìn)作用[5];高濃度的S100b在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有神經(jīng)毒性,通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮介導(dǎo)的死亡途徑引起神經(jīng)元的死亡。S100b通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)PI(磷脂酰肌醇)水解,其分解產(chǎn)物IP3(三磷酸肌醇)作用于肌漿網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣通道,使鈣通道開放,釋放Ca2+。Ca2+一方面和S100b結(jié)合引起其構(gòu)象改變進(jìn)而和細(xì)胞膜結(jié)合,使平滑肌纖維染色增強(qiáng);另一方面和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合,通過磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶(M LCK)使其失去對(duì)肌動(dòng)蛋白ATP酶的抑制,促使αaction肌絲滑行,引起腦血管平滑肌收縮,痙攣[6]。綜上所述,蛛網(wǎng)膜下腔出血后S100b的表達(dá)上調(diào),高濃度的S100b蛋白通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮介導(dǎo)的死亡途徑引起神經(jīng)元的死亡,腦血管平滑肌痙攣。但是有關(guān)于蛛網(wǎng)膜下腔出血后通過何種機(jī)制引起腦血管痙攣還有待于進(jìn)一步的研究。

圖3 S100b蛋白印跡圖

[1]D ietrich H H,Dacey R C Jr.Molecu lar keys to the problems of cerebral vasospasm[J].Neurosurgery,2000,46(3):517-530

[2]M oore BM.A solube protein characteristic of the nervous system[J].Biochem Biophy s Res Commun,1965,19(6):739-744

[3]Weir B.VasosPasm in response to repeated subarachnoid hemorrhage in the monkey[J].J NeurosUrg,1970,33:395

[4]Piepgras A.Characterization of an anterior circulation rat subaraehnoid hemorrhage model[J].Stroke,1995,26:395

[5]Donato R.Intracellular and extracellular roles of S100 protein[J].Microsc Res Tech,2003,60(6):540-551

[6]Lefranc F,Golzarian J,Chevalie C,et al.Expression of members of the calcium-binding S-100 protein family in a rat model of cerebral basilar artery vasospasm[J].J Neurosurg,2002,97(2):408-415