朱秋雙,任春清,包利澤,趙錦程,劉 蕾,白 雪,楊 玉

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯市中心醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154002;3.佳木斯中小學(xué)保健所,黑龍江 佳木斯154002)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又稱(chēng)原發(fā)性癡呆癥是一種與年齡高度相關(guān)的、以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病以潛隱性起病、癡呆緩慢進(jìn)行性加重為特征,臨床表現(xiàn)為記憶力、判斷力、抽象思維等一般智力的喪失,神經(jīng)病理改變可見(jiàn)神經(jīng)元變性、丟失引起的腦萎縮,細(xì)胞外的老年斑(senile plaque,SP)等。本病要經(jīng)歷兩種死亡,首先是精神死亡,然后是肉體死亡,給患者本人、家庭和社會(huì)帶來(lái)相當(dāng)沉重的負(fù)擔(dān)。何首烏為蓼科植物的塊根,具有補(bǔ)肝益腎,益髓延年之功,為傳統(tǒng)的益智藥。有報(bào)道何首烏對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能有促進(jìn)作用。本研究旨在進(jìn)一步觀察何首烏對(duì)Aβ1-40致AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用并探討其機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

Aβ1-40(美國(guó)Sigma公司),1:1何首烏硫浸膏(黑龍江省藥材公司提供并由佳木斯大學(xué)藥理教研室加工)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Y-迷宮:北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠,體重約200～220g,佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證黑動(dòng)字第99101001號(hào)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物篩選與分組

大鼠適應(yīng)環(huán)境1d后,先將大鼠放入Y型電迷宮中,適應(yīng)5min,使其對(duì)3臂均探索進(jìn)入,然后從I臂開(kāi)始隨機(jī)次序變換測(cè)試,給電壓30～70V,電流0.5～0.7mA,延遲時(shí)間 5s。電擊后大鼠逃避至安全區(qū)為正確反應(yīng),否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。每測(cè)1次休息30s,測(cè)10次休息5min。大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)以連續(xù)10次測(cè)試中有9次(9/10)正確反應(yīng)時(shí),所需電擊數(shù)表示。測(cè)試在上午進(jìn)行,連續(xù)30次未跑正確者被淘汰。再將動(dòng)物隨機(jī)分成3組:對(duì)照組,阿爾茨海默病模型組及何首烏硫浸膏治療組,每組10只。

1.4.2 Aβ孵育

用無(wú)菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成10μ g/μ L,37℃下孵育1周,使其變?yōu)榫奂癄畹腁β1-40。

1.4.3 動(dòng)物模型的制作[1]

大鼠腹腔注射濃度100g/L水合氯醛(0.35g/kg)麻醉動(dòng)物,然后固定于腦立體定位儀上,分開(kāi)筋膜于前囟后3.0mm,中線右側(cè)2.0mm處鉆開(kāi)顱骨,切開(kāi)硬腦膜后,自腦表面緩慢垂自進(jìn)針2.9mm(控制注射速度 0.2μ L/min),阿爾茨海默病模型組注射聚集狀 Aβ1-40 1μ L,留針 5min,然后緩慢撤針。對(duì)照組只注射等量生理鹽水,余操作同上。

1.4.4 分組給藥

大鼠醒后,何首烏組即何首烏硫浸膏25g/(kg?d)灌胃,每日分兩次(上午9時(shí)和下午4時(shí))。其余組均灌等量的生理鹽水。

1.4.5 大鼠分辨學(xué)習(xí)能力的檢測(cè)

各組在同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后 5、10、15、20d)按前述說(shuō)明進(jìn)行Y迷宮測(cè)試,規(guī)定大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)為“正確反應(yīng)”,以達(dá)到連續(xù)9次電擊為正確反應(yīng),所需的電擊次數(shù)表示其學(xué)習(xí)獲得能力。若次數(shù)超過(guò)30次則不再測(cè)試,并以30次為最大值計(jì)數(shù)。

1.4.6 記憶保持的觀察

用Y-迷宮檢測(cè)上述小鼠在達(dá)到分辨學(xué)習(xí)的學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)后24h記憶的保持,連續(xù)檢測(cè)10次記錄,其中正確反應(yīng)次數(shù),以記憶保持的百分?jǐn)?shù)表示。

1.4.7 形態(tài)學(xué)觀察[2]

在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,將大鼠拉斷頸椎處死,迅速取出全腦,10%福爾馬林溶液中固定72h,常規(guī)包埋石蠟切片,冠狀連續(xù)切片(厚度50μ m),海馬組織每 5張取1張,一個(gè)標(biāo)本取3張,HE染色×540光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞計(jì)量采用每 200μ m×400μ m長(zhǎng)度下正常細(xì)胞數(shù),每張切片觀察一個(gè)計(jì)量單位,取平均值為該標(biāo)本的細(xì)胞記數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果

結(jié)果表明術(shù)前各組學(xué)習(xí)能力基本一致。原發(fā)性癡呆癥模型組大鼠主動(dòng)逃避電擊次數(shù)明顯多于兩個(gè)對(duì)照組,且隨時(shí)間推移,所需電擊次數(shù)反而增加,說(shuō)明該組大鼠學(xué)習(xí)記憶獲得能力明顯下降。治療組在術(shù)后5d,10d與模型組無(wú)明顯差異(P＞0.05),但在15d后與模型組比較(△P＜0.05),且至術(shù)后20d時(shí)學(xué)習(xí)記憶獲得能力有明顯提高,與模型組比較(＊P＜0.01),與對(duì)照組比較(▲P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠迷宮學(xué)習(xí)能力的結(jié)果(n=10,± s,次)

表1 各組大鼠迷宮學(xué)習(xí)能力的結(jié)果(n=10,± s,次)

注:與對(duì)照組比較▲P ＜0.05,;與模型組比較△P＜0.05,＊P＜0.01。

組別 術(shù)前 術(shù)后5d 術(shù)后10d 術(shù)后15d 術(shù)后20d原發(fā)性癡呆癥模型組 13.1±2.1 25.4±5.6 26.7±6.1 26.6±6.1 27.5±5.3何首烏硫浸膏治療組 14.6±2.3 24.4±6.2 20.9±5.4 18.4±4.6△ 15.3±2.8＊▲_正常對(duì)照組___________________________________________________________________________________________________________________________________14.3±2.8_13.2±2.9_11.3±2.0_13.8±1.8_10.4±1.3

2.2 記憶保持的觀察和海馬細(xì)胞數(shù)

結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較,原發(fā)性癡呆癥模型組和何首烏硫浸膏治療組記憶能力均降低,海馬細(xì)胞數(shù)均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與原發(fā)性癡呆癥模型組比較,何首烏硫浸膏治療組記憶能力提高,海馬細(xì)胞數(shù)提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(△P ＜0.01),見(jiàn)表2。

表2 對(duì)大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力及海馬正常細(xì)胞數(shù)的影響(n=10,± s)

表2 對(duì)大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力及海馬正常細(xì)胞數(shù)的影響(n=10,± s)

注:與對(duì)照組比較＊P＜0.01,▲P＜0.05;與原發(fā)性癡呆癥模型組比較△P＜0.01。

組別 記憶能力(正確%) 海馬細(xì)胞數(shù)原發(fā)性癡呆癥模型組 47.49±2.99＊ 74.49±2.62＊何首烏硫浸膏治療組 65.56±3.33▲△ 83.53±3.91＊△正常對(duì)照組 69.22±3.98 98.12±2.69

3 討論

原發(fā)性癡呆是指在老年人衰老退化基礎(chǔ)上發(fā)生的癡呆,如早老性癡呆、老年性癡呆等。原發(fā)性癡呆的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。有研究認(rèn)為是39-43個(gè)氨基酸組成的Aβ沉積為特征的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,還證明Aβ的營(yíng)養(yǎng)作用和毒性作用取決于它從可溶性表明變?yōu)椴豢扇苄缘木奂癄顟B(tài)。目前認(rèn)為神經(jīng)毒性物質(zhì)Aβ在腦中廣泛沉積在原發(fā)性癡呆發(fā)病中起中心作用,能引發(fā)神經(jīng)元退化和凋亡等諸多病理過(guò)程,最后引起癡呆。由于海馬與學(xué)習(xí)記憶,特別是近記憶功能密切相關(guān),是原發(fā)性癡呆中最易受累的腦區(qū)之一[3]。因此本研究利用立體定向技術(shù)將聚集態(tài)Aβ注入大鼠右側(cè)海馬,用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,觀察到大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,海馬細(xì)胞數(shù)減少,阿爾茨海默病模型制作成功。何首烏具有補(bǔ)肝腎,益精血,烏須發(fā),強(qiáng)筋骨,延緩衰老功效。大鼠何首烏硫浸膏25g/(kg?d)灌胃,觀察到何首烏對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠的分辨學(xué)習(xí)及記憶保持能力有極大提高,對(duì)海馬細(xì)胞數(shù)有保護(hù)作用。因此通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可得出結(jié)論何首烏對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用,其具體機(jī)制可能與其抑制海馬細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[1]鄢嘉,曾超,吳云霞,等.續(xù)斷總皂苷對(duì)阿爾茨海默病小鼠_學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(3):324-325

[2]朱秋雙,劉明遠(yuǎn),劉蕾,等.青風(fēng)藤對(duì)嗎啡成癮小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2009,32(4):9-10

[3]Giovannel L,Gasamenti F,Scall C,et al.Differential effect of amyloid peptide Aβ1-40 injection into the rat nucleus basalis[J].Neuroscience,1995,66:781-782