劉亞楠 張國彬 馬立人

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 河北唐山 063000)

1989年，芬蘭科學(xué)家Kajander發(fā)現(xiàn)了一種能通過100nm濾菌器的微生物并于1990年申請了專利，其命名這種微生物為納米細(xì)菌(Nanobacteria Nb)[1]。目前，隨著對納米細(xì)菌及其致病性的研究不斷深入，已發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌與多種病理性鈣化疾病如腎結(jié)石、動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺結(jié)石等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過建立納米細(xì)菌致兔膽結(jié)石動(dòng)物模型并將從兔膽汁培養(yǎng)出的納米細(xì)菌再次感染實(shí)驗(yàn)兔，致使兔膽囊結(jié)石再次發(fā)生。驗(yàn)證了納米細(xì)菌符合科赫氏法則具有感染性并再次證實(shí)了納米細(xì)菌感染與膽結(jié)石的形成有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(許可證編號(hào):SCXK京2005－0002)雄性日本大耳白兔共計(jì)96只，月齡4個(gè)月，清潔級(jí);所有日本大耳白兔在華北煤炭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫22～23℃，單籠飼養(yǎng)，晝/夜各12小時(shí)交替，光照不足時(shí)以日光燈代替。實(shí)驗(yàn)之前，所有動(dòng)物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑 酶標(biāo)記免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒:芬蘭Nanobac OY公司;醫(yī)用吻合劑:中國廣州醫(yī)用膠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膽汁納米細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定。膽汁納米細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定的方法參照[2]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù)前采集所有日本大耳白兔耳靜脈血5mL，分離血清并用ELISA檢測(按照試劑盒說明書操作)，排除納米細(xì)菌抗體陽性實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組。①膽石癥患者膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔48只隨機(jī)分成3組:患者膽汁Nb感染組16只;DMEM全培養(yǎng)液(一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)液)空白對照組16只;Hap對照組16只。②日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔48只隨機(jī)分成3組，日本大耳白兔膽汁Nb感染組16只;DMEM全培養(yǎng)液空白對照組16只;滅活的Nb對照組16只。

1.3.4 膽囊內(nèi)注射用納米細(xì)菌懸液的制備。從膽汁(患者，日本大耳白兔)中培養(yǎng)得到的納米細(xì)菌進(jìn)行第2次傳代，然后繼續(xù)培養(yǎng)4周后，取出培養(yǎng)瓶，旋緊瓶口螺紋蓋，置于超聲清洗儀器中，超聲處理10分鐘，使貼附在培養(yǎng)瓶壁的納米細(xì)菌脫落，并使聚集成團(tuán)的納米細(xì)菌分散、混勻。應(yīng)用濁度法測量納米細(xì)菌培養(yǎng)液濁度，將濁度調(diào)整到355NTU的懸液，用1mL無菌注射器抽上述懸液0.3mL，共留取16只注射器，將盛有納米細(xì)菌注射液的注射器至無菌容器內(nèi)，送動(dòng)物中心備用。

納米級(jí)羥基磷灰石懸液(Hap懸液)的制備:模擬人體細(xì)胞外液環(huán)境下合成的羥基磷灰石，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)孵育4周，然后按照納米細(xì)菌懸液的制備方法制成羥基磷灰石懸液，用1mL無菌注射器抽上述混懸液0.3mL，共留取8只注射器，將注射器至一無菌容器內(nèi)，送動(dòng)物中心備用。

注射用DMEM全培養(yǎng)液的制備:納米細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)所使用的含10%γ射線照射過的胎牛血清(γ－FBS)和1%4－羥2基哌嗪乙磺酸;N－(2－羥乙基)哌嗪－N’－2－乙烷磺酸(HEPES)緩沖液的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)條件下孵育4周。倒置顯微鏡下觀察無納米細(xì)菌生長。用1mL無菌注射器抽上述DMEM全培養(yǎng)液0.3mL，共留取16只注射器(兩次實(shí)驗(yàn)分別為16只)，將注射器至一無菌容器內(nèi)，送動(dòng)物中心備用。

干烤滅活納米細(xì)菌懸液的制備:180℃干烤4小時(shí)滅活的納米細(xì)菌在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)條件下持續(xù)孵育4周，倒置顯微鏡下觀察納米細(xì)菌未見生長。按照納米細(xì)菌懸液的制備方法制成滅活組納米細(xì)菌懸液，用1mL無菌注射器抽上述懸液0.3mL，共留取8只注射器，將注射器至一無菌容器內(nèi)，送動(dòng)物中心備用。

1.3.5 動(dòng)物感染。將動(dòng)物麻醉后，于右肋緣下開腹，肝下尋找膽囊，抽出膽囊膽汁，注入實(shí)驗(yàn)用懸液，生物膠封閉膽囊壁穿刺孔，關(guān)腹，肌肉注射青霉素3天(40萬單位/次/日)，單籠飼養(yǎng)3周，耳緣靜脈采血5mL后麻醉處死。抽取膽汁后剖開膽囊觀察成石情況并收集膽結(jié)石。見圖1。

圖1 剖開膽囊觀察成石

圖2 納米細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

圖3 納米細(xì)菌間接免疫熒光

2 結(jié)果

2.1 膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng) 6份的膽汁標(biāo)本納米細(xì)菌培養(yǎng)均為陽性，培養(yǎng)至第4周鏡下可見多數(shù)細(xì)菌集落貼附于培養(yǎng)瓶底部，見圖2。鏡下觀察陰性對照培養(yǎng)液，未見納米細(xì)菌生長。

2.2 膽汁納米細(xì)菌的鑒定 細(xì)菌與8D10抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，圖3中可見發(fā)出綠色熒光的納米細(xì)菌。陰性對照未觀察到綠色熒光。見圖3。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況 在實(shí)驗(yàn)過程中，所有動(dòng)物飲食飲水良好，無厭食表現(xiàn)，無疾病發(fā)生及意外死亡，膽石癥患者膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)開始時(shí)日本大耳白兔平均體重為(2.13±0.31)kg，各組間實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)日本大耳白兔平均體重約(2.27±0.42)kg，實(shí)驗(yàn)前后各組日本大耳白兔體重改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)開始時(shí)實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔平均體重為(2.08±0.65)kg，各組間實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)日本大耳白兔平均體重約為(2.10±0.68)kg，實(shí)驗(yàn)前后各組日本大耳白兔體重改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩次實(shí)驗(yàn)前后日本大耳白兔平均體重比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 ELISA檢測結(jié)果 兩次動(dòng)物感染性實(shí)驗(yàn)干預(yù)前動(dòng)物血清檢測結(jié)果均為陰性。

2.5 成石率比較 膽石癥患者膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)中患者膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)物感染組膽結(jié)石發(fā)生率明顯高于DMEM空白對照組和羥基磷灰石對照組，見表1。日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)中日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)物感染組膽結(jié)石發(fā)生率明顯高于DMEM空白對照組和滅活納米細(xì)菌對照組，見表2。兩次實(shí)驗(yàn)感染組成石率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 膽石癥患者膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)中各組膽結(jié)石發(fā)生率的比較(例)

表2 日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)中各組膽結(jié)石發(fā)生率的比較(例)

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，納米細(xì)菌廣泛存在于自然界的礦物質(zhì)中和生物體內(nèi)，能感染人類、牛、鹿和其它哺乳動(dòng)物，是一種人畜共患的致病原[2]。1999年，Ciftcioglu對72例來自芬蘭的腎結(jié)石標(biāo)本進(jìn)行納米細(xì)菌培養(yǎng)和單克隆抗體免疫熒光染色鑒定，有70例呈陽性，表明97.12%的腎結(jié)石中含有納米細(xì)菌[3]。

王利民等人將培養(yǎng)的納米細(xì)菌注射到日本大耳白兔的膽囊內(nèi)，2周后誘發(fā)出了膽囊黑色素結(jié)石[4]，我們采用類似的方法對感染組日本大耳白兔進(jìn)行感染[5]。為了防止所用的實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔已被納米細(xì)菌感染，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，我們對剛購買的實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔于耳緣靜脈進(jìn)行了采血，分離血清后進(jìn)行了ELISA檢測，檢測結(jié)果均為陰性，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔未被納米細(xì)菌感染，能夠用于本研究，這與對注射懸液干預(yù)前所抽取的膽汁進(jìn)行了納米細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性結(jié)果相符。

為明確膽結(jié)石患者膽汁納米細(xì)菌感染對實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔的致石作用，我們設(shè)立DMEM全培養(yǎng)液代替納米細(xì)菌注射作為實(shí)驗(yàn)對照。由于納米細(xì)菌能在不利于生長的情況下，利用環(huán)境中的鈣、磷合成主要由羥基磷灰石構(gòu)成的細(xì)菌被膜(biofilm)，來抵御不良環(huán)境的侵襲。體外研究表明:磷酸鈣有促進(jìn)膽石形成的作用[6]，因此我們用無機(jī)法合成的納米級(jí)羥基磷灰石懸液代替納米細(xì)菌懸液，注入日本大耳白兔膽囊內(nèi)作為對照，觀察納米級(jí)羥基磷灰石對實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔的成石作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:單純膽汁納米細(xì)菌感染確實(shí)能導(dǎo)致日本大耳白兔膽囊結(jié)石的發(fā)生。而羥基磷灰石對照組16只實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔中，也僅有3只發(fā)生膽囊結(jié)石，結(jié)石發(fā)生率為18.75%，與感染組比較，兩組差異顯著(P＜0.01)。為了避免注射物的量效差異引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，我們注射納米細(xì)菌懸液及羥基磷灰石懸液濁度均為355NTU，相當(dāng)于濃度為107/mL，并且注入劑量均為0.3mL。這一結(jié)果表明:雖然羥基磷灰石作為一種促成核因子，在體外實(shí)驗(yàn)中有促進(jìn)膽石形成的作用，但是由于正常機(jī)體的膽囊中存在抑成核因子，例如鈣結(jié)合蛋白等即可抑制了羥基磷灰石在正常日本大耳白兔膽囊內(nèi)的促成石作用，從而使羥基磷灰石組的實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔并沒有出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的膽囊結(jié)石。而納米細(xì)菌被驟然從營養(yǎng)豐富、適于生長的環(huán)境中，移入含有高濃度的膽汁酸鹽、磷脂、膽固醇及抗體(如SIgA)等不利的膽汁環(huán)境中時(shí)，則開始迅速利用膽汁中的鈣、磷成分合成羥基磷灰石外殼，并與其它正在礦化的納米細(xì)菌聚集成團(tuán)，使之不斷成長增大，破壞膽囊膽汁凝膠體系的動(dòng)態(tài)平衡，使膽固醇、膽紅素鈣鹽等成分析出，并為其進(jìn)一步沉積提供始動(dòng)的核心，進(jìn)而導(dǎo)致膽囊結(jié)石的形成。另外，對照組總共32只實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔中有4只日本大耳白兔在手術(shù)之后3周時(shí)發(fā)生了膽囊結(jié)石，而ELISA檢測結(jié)果均為陰性，說明對照組實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔并未被納米細(xì)菌感染，考慮手術(shù)本身對日本大耳白兔膽囊內(nèi)膽汁的膠體平衡體系也可能造成一定影響，可能是實(shí)驗(yàn)日本大耳白兔手術(shù)后形成膽囊結(jié)石的一個(gè)誘因。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證納米細(xì)菌具有感染性，我們設(shè)立了日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌感染性實(shí)驗(yàn)，感染組共16日本大耳白兔，手術(shù)注射納米細(xì)菌3周后，9只產(chǎn)生膽囊結(jié)石，結(jié)石發(fā)生率為56.25%，而DMEM對照組16只日本大耳白兔中有1只發(fā)生膽囊結(jié)石，結(jié)石發(fā)生率為6.25%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩組差異顯著(P＜0.01)，這與第一次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。16只注射干烤滅活的納米細(xì)菌懸液的對照組中有2只發(fā)生膽囊結(jié)石，結(jié)石發(fā)生率為12.50%，與感染組比較，兩組差異顯著(P＜0.01)，這說明經(jīng)過高溫干烤過的納米細(xì)菌處于失活狀態(tài)，其致病性消失，不能再利用鈣、磷成分合成羥基磷灰石外殼及聚集成團(tuán)，喪失了致結(jié)石能力。無論是羥基磷灰石還是干烤滅活的納米細(xì)菌其成石率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有活性的納米細(xì)菌，這從側(cè)面證明納米細(xì)菌作為一種生物存在于自然界。另外，我們對膽結(jié)石患者膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)物感染組與日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)物感染組結(jié)石發(fā)生率進(jìn)行了比較(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無論是人膽汁培養(yǎng)出的納米細(xì)菌還是日本大耳白兔膽汁培養(yǎng)出的納米細(xì)菌都具有促進(jìn)膽結(jié)石形成的作用，但日本大耳白兔膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)物感染組成石數(shù)量比膽結(jié)石患者膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)物感染組少4個(gè)，可能是因?yàn)榧{米細(xì)菌經(jīng)傳代培養(yǎng)后其致病性減弱的緣故。

[1]Kajander EO.Culture and detection method for sterilefilterable autonomously replicating biological particles[J].US patent，1992，5:135，851

[2]Barr SC，Linke RA，Janssen D，et al.Detection of biofilmformation and nanobacteria under long－term cell culture conditions in serum samples of cattle，goats ，cats ，and dogs[J].AmJ Vet Res，2003，64(2):176

[3]Ciftcioglu N，Bjorklund M，Kuorikoski K，et al.Nanobacteria:an infectious cause for kidney stone formation[J].Kidney Int，1999，56:1893

[4]Wang L，Shen W，Wen J，et al.An animal model of black pigment gallstones caused by nanobacteria[J].Dig Dis Sci，2006，51(6):1126

[5]劉亞楠，王興偉，馬立人.膽汁納米細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，13(3):312

[6]Vanden Berg AA，Van Buul JD，Tytgat GN，et al.Mucins and calcium phosphate precipitates additively stimulate cholesterol crystallization[J].J Lipid Res，1998，39(9):1744