張 勇 崔 巖 陶 亮 朱宇旌 鄧 科 孫 璀 邵彩梅

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866;2.遼寧禾豐牧業(yè)股份有限公司，沈陽(yáng) 110164)

飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)肥育豬背最長(zhǎng)肌嫩度及骨骼肌特異性蛋白－核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)途徑的影響

張 勇1崔 巖1陶 亮1朱宇旌1鄧 科1孫 璀1邵彩梅2

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866;2.遼寧禾豐牧業(yè)股份有限公司，沈陽(yáng) 110164)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧理想蛋白質(zhì)水平對(duì)背最長(zhǎng)肌嫩度及骨骼肌特異性蛋白－核轉(zhuǎn)錄因子κB(P94-NFκB)信號(hào)途徑相關(guān)蛋白和鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)mRNA表達(dá)量的影響。選擇初始重約50 kg的杜洛克×長(zhǎng)白×大白三元雜交豬90頭，隨機(jī)分配到3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭，公母各占1/2。3個(gè)處理分別采用12%、16%、20%理想蛋白質(zhì)水平的飼糧，飼糧能量水平相同。正試期58 d，結(jié)束后屠宰取樣，測(cè)定肌肉剪切力并利用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定豬背最長(zhǎng)肌P94、NFκB、核轉(zhuǎn)錄因子抑制物(IκB)和CAST mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明:1)飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)背最長(zhǎng)肌剪切力、P94、NFκB、IκB和CAST mRNA表達(dá)量有顯著影響(P＜0.05);隨飼糧蛋白質(zhì)水平升高，背最長(zhǎng)肌剪切力、IκB和 CAST mRNA表達(dá)量升高、P94和NFκB mRNA 表達(dá)量降低。2)背最長(zhǎng)肌剪切力與 IκB(相關(guān)系數(shù)為 0.513，P＜0.05)、CAST mRNA表達(dá)量(相關(guān)系數(shù)為0.816，P＜0.01)呈正相關(guān)。3)CAST與P94 mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為 －0.496，P＜0.05)，與 IκB mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為 0.710，P＜0.01)。4)P94 與 NFκB mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為 0.550，P＜0.05)，與 IκB mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為－0.518，P＜0.05);IκB與NFκB mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為－0.539，P＜0.05)。結(jié)果提示:飼糧高蛋白質(zhì)水平提高了豬背最長(zhǎng)肌剪切力、CAST和IκB mRNA表達(dá)量，降低了肌肉嫩度和P94 mRNA表達(dá)量;豬背最長(zhǎng)肌P94-NFκB信號(hào)途徑在肌肉嫩度調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮一定作用，但不是主要途徑。

蛋白質(zhì)水平;鈣蛋白酶抑制蛋白;骨骼肌特異性蛋白;核轉(zhuǎn)錄因子κB;肌肉嫩度

肉品質(zhì)直接影響到養(yǎng)殖業(yè)、肉類(lèi)加工業(yè)和批發(fā)零售業(yè)效益以及廣大消費(fèi)者的切身利益，如何提高肉品質(zhì)已成為當(dāng)今學(xué)者共同關(guān)心的一項(xiàng)重大課題。嫩度作為評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)而倍受矚目。在肌肉組織中，鈣蛋白酶系(calpains)控制著肌纖維蛋白的降解，這一過(guò)程是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速步驟［1］，鈣蛋白酶系在肌肉纖維更新及宰后的嫩化中扮演著重要角色［2］。骨骼肌特異性蛋白酶(P94，又名 calpain-3、CAPN3)和鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)都屬于鈣蛋白酶系統(tǒng)的一員。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NFκB)廣泛存在于真核生物中，是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞基組成的蛋白質(zhì)家族，在肌細(xì)胞形成、肌細(xì)胞再生和細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用。骨骼肌特異性蛋白酶－核轉(zhuǎn)錄因子κB(P94-NFκB)信號(hào)途徑與肌細(xì)胞核凋亡密切相關(guān)。近年來(lái)，對(duì)P94的研究多集中于P94多態(tài)性的分析［3－4］，對(duì) NFκB 和核轉(zhuǎn)錄因子抑制物(IκB)的研究多集中在干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域及肌肉疾病的研究［5－6］，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用很少，并且對(duì) P94-NFκB信號(hào)途徑與肌肉嫩度的聯(lián)系更是鮮見(jiàn)報(bào)道。曾有報(bào)道利用分子生物學(xué)技術(shù)手段研究飼糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)肌肉嫩度的影響，從微觀角度探討相關(guān)基因表達(dá)對(duì)肌肉嫩度的調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)考察飼糧理想蛋白質(zhì)水平對(duì)生長(zhǎng)肥育豬肌肉CAST和P94-NFκB信號(hào)途徑的影響，明確 CAST與 P94-NFκB信號(hào)途徑在豬肌肉嫩度調(diào)控中的作用，為改善豬肉品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

數(shù)顯式肌肉嫩度儀(C-LM 3型，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院研制);高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-20M，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)(Cary 50 Probe，美國(guó) Varian公司);基因擴(kuò)增儀［TC-96/G/H(6)，杭州博日科技有限公司］;PCR儀(ABIPRISM 7000 HT Real-Time RCR System，美國(guó)ABI公司);凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá))。

1.2 試驗(yàn)試劑

RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)、熒光定量PCR(real time-PCR，RT-PCR)試劑盒［SYBRPrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)］、DEPC水、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)、50 bp DNA Ladder Marker均購(gòu)自于TaKaRa公司;瓊脂糖購(gòu)自于寶泰克(西班牙)公司;其他常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇初始重約50 kg的杜洛克×長(zhǎng)白×大白三元雜交豬90頭，隨機(jī)分配到3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭，公母各占1/2。3個(gè)處理分別采用12%、16%、20%理想蛋白質(zhì)水平的飼糧，飼糧能量水平相同，正試期58 d，參照NRC(1998)肥育豬的營(yíng)養(yǎng)需要配合成粉狀全價(jià)料，飼糧消化能保持相同。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)、防疫、編號(hào)等工作。試驗(yàn)豬水泥地面單圈飼養(yǎng)，自由采食，以鴨嘴式飲水器提供充足清潔飲水，日飼喂3次，清糞3次，保持舍內(nèi)清潔，隨時(shí)觀察并記錄飼養(yǎng)期間豬的食欲、精神狀況、糞便等情況。

1.5 樣品采集制備

為了使胴體盡量少受破壞，肉樣采集位置為豬最后肋骨和最后腰椎間的單側(cè)背最長(zhǎng)肌，采樣400 g，用于肉品質(zhì)測(cè)定;并在最短的時(shí)間內(nèi)于第13～16肋骨間取豬背最長(zhǎng)肌樣本30 g，放入錫箔紙中包好，用液氮迅速冷凍，之后放于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 肌肉嫩度測(cè)定

采用C-LM 3型數(shù)顯式肌肉嫩度儀測(cè)定肉樣剪切力值，具體試驗(yàn)步驟參考張勇等［7－8］文獻(xiàn)。

1.7 利用RT-PCR測(cè)定相關(guān)蛋白m RNA表達(dá)量

1.7.1 總 RNA 提取

參照RNA提取試劑盒推薦方法，提取豬背最長(zhǎng)肌樣品總RNA。提取后的RNA用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)OD260nm/OD280nm檢驗(yàn)純度，并按如下公式計(jì)算RNA的濃度:

1.7.2 cDNA 合成

按照RT-PCR試劑盒操作方法進(jìn)行。cDNA合成后放－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本試驗(yàn)選擇β－肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，用相對(duì)定量的方法，測(cè)定肥育豬 P94、NFκB、IκB、CAST的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物均由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2。

1.7.4 RT-PCR

β-actin、P94、NFκB、IκB PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系均為25μL:TaKaRa SYBR Prem ix Ex Taq(2×)12.5 μL，上游、下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，Rox Reference Dye(50 × )0.5 μL，模板cDNA溶液2μL，RNase-free H2O 9μL。

反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 m in;94℃變性30 s，59～63℃退火30 s(具體基因的退火溫度見(jiàn)表2)，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán);72℃最后延伸2 m in。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis) %

1.7.5 電泳

將預(yù)先配制好的加溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠融化，冷卻至約60℃，倒入裝好梳子的膠槽內(nèi)，使凝膠厚度為5～7 mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠放入裝有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，將5μL PCR產(chǎn)物與1μL電泳上樣緩沖液(6×Loading buffer)混合后，點(diǎn)樣。同時(shí)于樣品旁邊點(diǎn)5μL DL2000 DNA Maker作為分子量標(biāo)記，110 V電壓電泳20 m in。紫外線下觀察結(jié)果，并拍照記錄。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所的ABI Prism 7000 SDS software 1.5進(jìn)行相對(duì)定量分析。采用2－△△Ct的計(jì)算方法計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量，用 SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用LSD法和Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 背最 長(zhǎng) 肌剪 切 力 及 P94、NFκB、IκB 和CAST m RNA表達(dá)量

從表3可見(jiàn)，背最長(zhǎng)肌剪切力隨飼糧蛋白質(zhì)水平的升高而升高，20%組顯著高于12%、16%組(P＜0.05)。豬背最長(zhǎng)肌 P94、NFκB mRNA 表達(dá)量隨飼糧蛋白質(zhì)水平的升高而降低，其中P94 mRNA表達(dá)量在20%組與12%、16%組之間差異顯著(P＜0.05)，而 NFκB mRNA 表達(dá)量在不同組之間差異不顯著(P＞0.05)。豬背最長(zhǎng)肌 IκB、CAST mRNA表達(dá)量隨飼糧蛋白質(zhì)水平的升高而升高，其中IκB mRNA表達(dá)量20%組與16%組之間差異顯著(P＜0.05)，20%組與12%組差異極顯著(P＜0.01)，而 CAST mRNA表達(dá)量在20%組與12%、16%組之間差異極顯著(P＜0.01)。所有基因mRNA表達(dá)量在16%組與12%組之間差異均不顯著(P＞0.05)。

表2 引物序列及實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件Table 2 Primer sequences and the conditions for real-time PCR

表3 飼糧不同蛋白質(zhì)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌剪切力及P94、NFκB、IκB和CAST m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響Table 3 Effects of dietary protein level on the shear force and P94、NFκB、IκB and CAST mRNA relative expression levels of longissimus dorsi in pigs

2.2 背最 長(zhǎng)肌剪 切 力 與 P94、NFκB、IκB 和CAST m RNA表達(dá)量相關(guān)性

由表4可見(jiàn)，背最長(zhǎng)肌剪切力與 P94、NFκB mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，剪切力隨背最長(zhǎng)肌P94、NFκB mRNA表達(dá)量的降低而升高，相關(guān)系數(shù)分別為－0.453、－0.181，但相關(guān)性不顯著(P＞0.05)。背最長(zhǎng)肌剪切力與IκBmRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，剪切力的值隨背最長(zhǎng)肌IκB mRNA表達(dá)量的升高而升高，相關(guān)系數(shù)為0.513，相關(guān)性顯著(P＜0.05)。背最長(zhǎng)肌剪切力與CAST mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，剪切力隨背最長(zhǎng)肌CAST m RNA表達(dá)量的升高而升高，相關(guān)系數(shù)為0.816，相關(guān)性極顯著(P＜0.01)。

表4 豬背最長(zhǎng)肌剪切力與P94、NFκB、IκB和CAST m RNA相對(duì)表達(dá)量回歸方程Table 4 Regression equations between shear force and mRNA relative expression levels of P94，NFκB，IκB and CAST of longissimus dorsi in pigs

2.3 背最長(zhǎng)肌 P94、NFκB、IκB 與 CAST m RNA表達(dá)量的相關(guān)性

由表5可見(jiàn)，CAST與P94、NFκB mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 －0.496、－0.224，其中CAST與P94 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性顯著(P＜0.05)。CAST 與 IκB mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.710，相關(guān)性極顯著(P＜0.01)。

表5 豬背最長(zhǎng)肌CAST與P94、NFκB、IκB m RNA相對(duì)表達(dá)量回歸方程Table 5 Regression equations formRNA relative expression levels of CAST and P94，NFκB and IκB of longissimus dorsi in pigs

2.4 背最長(zhǎng)肌 P94、NFκB、IκB m RNA 表達(dá)量三者之間的相關(guān)性

由表6可見(jiàn)，P94與NFκB mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.550，隨著P94 mRNA表達(dá)量的增加，NFκB mRNA表達(dá)量也隨之增加，相關(guān)性顯著(P＜0.05)。P94與 IκB mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 －0.518，隨著P94 mRNA表達(dá)量的增加，IκB mRNA表達(dá)量降低，相關(guān)性顯著(P＜0.05)。IκB 與 NFκB mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 －0.539，隨著 IκB mRNA 表達(dá)量的增加，NFκB mRNA表達(dá)量降低，相關(guān)性顯著(P＜0.05)。

表6 豬背最長(zhǎng)肌P94與NFκB、IκB m RNA相對(duì)表達(dá)量回歸方程Table 6 Regression equations formRNA relative expression levels of NFκB，P94 and IκB of longissimus dorsi in pigs

3 討論

3.1 理想蛋白質(zhì)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌剪切力的影響

理想蛋白質(zhì)是氨基酸平衡最佳的蛋白質(zhì)。飼糧蛋白質(zhì)不足，肌肉蛋白質(zhì)合成受阻，未被利用的能量以脂肪的形式沉積下來(lái)，使肌內(nèi)脂肪含量增加;提高飼糧蛋白質(zhì)水平有促進(jìn)蛋白質(zhì)沉積的作用。Davey等［9］發(fā)現(xiàn)，用高蛋白質(zhì)飼糧飼喂瘦肉型豬，可提高瘦肉率，降低肌肉內(nèi)脂肪水平，肉的嫩度下降。Goerl等［10］研究了飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)28～104 kg豬肉品質(zhì)的影響，同樣發(fā)現(xiàn)，隨飼糧蛋白質(zhì)水平的增加，胴體背膘厚下降、瘦肉率增加、肉嫩度下降。張克英等［11］研究表明，隨飼糧理想蛋白質(zhì)水平的提高，肌肉率趨于增加、肌肉脂肪含量顯著下降。何若鋼等［12］采用3個(gè)能量水平和3個(gè)蛋白質(zhì)水平對(duì)生長(zhǎng)期特種野豬屠宰性能的影響進(jìn)行了評(píng)定，肌肉剪切力、瘦肉率隨飼糧蛋白質(zhì)水平的增加而增加。在本試驗(yàn)中隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的提高，肌肉剪切力也隨之提高，與上述研究結(jié)果相一致。低蛋白質(zhì)水平能提高肉的嫩度，其原因可能是肌肉內(nèi)脂肪含量的升高和低蛋白質(zhì)飼糧促使體內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)加快所致。

3.2 理想蛋白質(zhì)水平對(duì) CAST和 P94-NFκB信號(hào)途徑相關(guān)蛋白m RNA表達(dá)量的影響

隨著營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)的不斷發(fā)展，營(yíng)養(yǎng)水平與基因型之間的互作逐步被人們所認(rèn)識(shí)。鈣蛋白酶系統(tǒng)在骨骼肌肌絲蛋白降解過(guò)程中起到重要作用，存在于絕大多數(shù)細(xì)胞中［13］。飼糧蛋白質(zhì)水平會(huì)影響動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝，有可能也會(huì)影響骨骼肌中有關(guān)蛋白質(zhì)降解的基因。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著飼糧理想蛋白質(zhì)水平的升高，CAST mRNA表達(dá)量顯著升高，而P94 mRNA表達(dá)量顯著降低。P94是calpains的成員之一，而CAST正是calpains的抑制劑，CAST mRNA表達(dá)量的增加或減少必然會(huì)引起calpainsmRNA表達(dá)量的減少或增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符合。Senskypl等［14］曾研究表明，注射生長(zhǎng)激素和飼喂β－興奮劑克倫特羅均可改變背最長(zhǎng)肌CAST mRNA表達(dá)量，但P94與NFκB未發(fā)生變化，提出生長(zhǎng)激素和β－興奮劑對(duì)CAST mRNA表達(dá)的調(diào)控與P94-NFκB信號(hào)途徑無(wú)關(guān)。本試驗(yàn)中飼糧理想蛋白質(zhì)水平對(duì)P94、IκB mRNA表達(dá)量有顯著影響，但對(duì)NFκB mRNA表達(dá)量無(wú)顯著性影響，這表明理想蛋白質(zhì)水平對(duì)P94-NFκB信號(hào)途徑存在一定影響，但具體的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.3 CAST和P94-NFκB信號(hào)途徑對(duì)肌肉嫩度的影響

肉的嫩度好壞是肌肉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的反映，在一定程度上反映了肌原纖維、結(jié)締組織以及肌肉脂肪的含水量、分布和化學(xué)結(jié)構(gòu)［15］。CAST是細(xì)胞內(nèi)專(zhuān)一抑制calpain活性的蛋白質(zhì)，CAST是通過(guò)抑制calpain的自溶作用而發(fā)揮作用的，且這種抑制作用并不受 pH 的影響［16］。Delgado 等［17］發(fā)現(xiàn)，降解后的CAST同樣具有抑制calpain的活性，并發(fā)現(xiàn)肉的嫩化與CAST活性及降解速度有關(guān)。Melody等［18］研究表明，CAST與肌肉發(fā)育之間存在密切關(guān)系，CAST能提高肌肉的嫩度，指出通過(guò)調(diào)節(jié)calpain和CAST的活性可調(diào)節(jié)肌肉的發(fā)育，從而提高家畜的瘦肉率和產(chǎn)出率，提高肌肉的質(zhì)量。Koohmaraie等［19］研究認(rèn)為，高水平的 CAST抑制宰后肌肉蛋白水解和嫩化。程豐等［20］發(fā)現(xiàn)，CAST的基因型與豬肉的嫩度存在相關(guān)性，為CAST作為豬肉嫩度的候選基因奠定了基礎(chǔ)。武艷群等［21］試驗(yàn)進(jìn)一步證明CAST是一個(gè)與肉質(zhì)相關(guān)性非常高的候選基因。曾有試驗(yàn)表明CAST mRNA表達(dá)量與肌肉嫩度顯著相關(guān)［7－8］。本試驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)CAST與肌肉嫩度存在顯著相關(guān)性，CAST mRNA表達(dá)量的增加降低豬背最長(zhǎng)肌嫩度。

P94-NFκB信號(hào)途徑與肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Ouali等［22］推斷，動(dòng)物宰后應(yīng)該有一個(gè)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，從微觀角度看，肌肉的成熟嫩化是肌細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)而繼發(fā)性壞死的過(guò)程，因此，細(xì)胞凋亡與肌肉的成熟嫩化有著密切的關(guān)系。P94是骨骼肌NFκB信號(hào)途徑的上游調(diào)節(jié)者，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，維持肌核功能。2A型臍帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者肌肉中P94的表達(dá)缺陷導(dǎo)致IκB-α在患者肌肉中積累，從而減弱NFκB對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，導(dǎo)致肌核程序性細(xì)胞凋亡［23］。Ojima等［24］探討了 P94在骨骼肌細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)途徑中的作用，試驗(yàn)結(jié)果指出P94受肌纖維的種類(lèi)、肌纖維的收縮、肌節(jié)的成熟化的影響。Kimberly等［25］研究發(fā)現(xiàn)鼠的肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)主要是由P94的活性引起的。Murphy等［26］在鼠的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)P94的活性與肌纖維密切聯(lián)系。沙玉圣等［27］試驗(yàn)證明通過(guò)上調(diào)半腱肌P94 mRNA的表達(dá)可顯著改善半腱肌的嫩度。但Parr等［28］的研究表明，P94與豬背最長(zhǎng)肌的嫩度并沒(méi)有直接的關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:P94 mRNA表達(dá)量與豬背最長(zhǎng)肌嫩度存在負(fù)相關(guān)性，但是相關(guān)性不顯著，本結(jié)果與Parr等的結(jié)論相符合。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示NFκB mRNA表達(dá)量與豬背最長(zhǎng)肌嫩度沒(méi)有相關(guān)性，這表明P94-NFκB信號(hào)途徑與豬背最長(zhǎng)肌嫩度并無(wú)明顯關(guān)系。對(duì)于P94-NFκB信號(hào)途徑與肌肉嫩度的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道，其間具體的相關(guān)性還有待研究。

4 結(jié)論

①飼糧高蛋白質(zhì)水平提高了豬背最長(zhǎng)肌剪切力、降低了肌肉嫩度。

②飼糧高蛋白質(zhì)水平提高了豬背最長(zhǎng)肌CAST mRNA表達(dá)量;對(duì)P94-NFκB信號(hào)途徑上游調(diào)節(jié)者顯著降低了P94和IκB mRNA表達(dá)量分別起到降低和提高的作用。

③豬背最長(zhǎng)肌剪切力與IκB mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)、與 P94、NFκB mRNA表達(dá)量呈不顯著負(fù)相關(guān)，表明豬背最長(zhǎng)肌P94-NFκB信號(hào)途徑在肌肉嫩度調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮一定作用，但不是主要途徑。

［1］HUANG J，NEIL E F.Role of calpain in skeletalmuscle protein degradation［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95:12100－12105.

［2］HOPKINSD L，THOMPSON JM.Inhibition of protease activity.Part1.The effecton tenderness and indicators of proteolysis in ovinemuscle［J］.Meat Science，2001，59:175－185.

［3］ILIAN M A，BEKHIT A E D，STEVENSON B，et al.Up and down-regulation of longissimus tenderness parallels changes in themyofibril-bound ealpain 3 protein［J］.Meat Science，2004，67:433 －445.

［4］LARSEN N J，KENEALY S，TUGGLE C K，et al.Rapid communication:a HincⅡmorphism in the porcine calpain，large polypeptide L3(CAPN3)gene［J］.Journal of Animal Science，1998，76:918 －919.

［5］MATSUO H， TAMURA M，KABASHIMA N.Prednisolone inhibits hyperosmolarity-induced expression of MCP-1 via NF-kappaB in peritonealmesothelial cells［J］.Kidney International，2006，69(4):736－746.

［6］KAFOURY R M，HEMANDEZ JM，LASKY JA，et a1.Activation of transcription factor IL-6(NF-IL-6)and nuclear factor-kappaB(NF-kappaB)by lipid ozonation products is crucial to imerleukin-8 gene expression in human airway epithelial cells［J］.Environmental Toxicology，2007，22(2):159－168.

［7］張勇，高彥，朱宇旌，等.不同飼喂方式對(duì)豬背最長(zhǎng)肌鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶基因表達(dá)及剪切力的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22(3):640－646.

［8］張勇，李方方，朱宇旌，等.日糧不同蛋白質(zhì)水平對(duì)豬骨骼肌鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶基因表達(dá)及嫩度的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，20(3):360－365.

［9］DAVEY R J.Grow th and carcass characteristics of high-and low-fatsw ine fed diets varying in protein and lysine content［J］.Journal of Animal Science，1976，43:598－605.

［10］GOERL K F，EILERT S J，MANDIGO RW，et al.Pork characteristics as affected by two populations of sw ine and six crude protein levels［J］.Journal of Animal Science，1995，73:3621－3626.

［11］張克英，陳代文，羅獻(xiàn)梅，等.飼糧理想蛋白水平對(duì)豬肉品質(zhì)的影響［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，20(1):37－39.

［12］何若鋼，馮譽(yù)齡，李秀寶，等.不同能量和但蛋白水平對(duì)生長(zhǎng)期特種野豬屠宰性能的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009(4):112－113.

［13］ILIAN M A，BEKHITA E D，BICKERSTAFFE R.The relationship between meat tenderization，myofibril fragmentation and autolysis of calpain 3 during post-mortem aging［J］.Meat Science，2004，66:387－397.

［14］SENSKYP L，JEWELL K K，RYAN K J，et al.Effect of anabolic agents on calpastatin promoters in porcine skeletalmuscle and their responsiveness to cyclic adenosine monophosphate and calcium-related stimuli［J］.Journal of Animal Science，2006，84(11):2973－2982.

［15］李德發(fā).營(yíng)養(yǎng)調(diào)控肉品質(zhì)量的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［C］//動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展論文集.北京:農(nóng)業(yè)科技出版社，2004:7－14.

［16］ROMAN L，HRUSKA U S.Effect of calpastatin on degradation of myofibrillar proteins by calpain under postmortem conditions［J］.Journal of Animal Sci-ence，1999(7):685－692.

［17］DELGADO E F，GEESIN G H，MARCHELLO JA，et al.The calpain system in three muscles of normal and callipyge sheep［J］.Journal of Animal Science，2001，79:398－412.

［18］MELODY J L，LONERQAN S M，ROWE L J，et al.Early postmortern bilchem ical factor influence tenderness and water-holding capacity of three porcine musles［J］.Journal of Animal Science，2004，82:1195－1205.

［19］KOOHMARAIE M，GEESINK G H.Contribution of postmortem muscle biochem istry to the delivery of consistent meat quality with particular focus on the calpain system［J］.Meat Science，2006，74:34 －43.

［20］程豐，趙云煥，易本馳，等.豬 CAST基因 PCRRFLPs與肉質(zhì)相關(guān)性的分析［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(2):103－106.

［21］武艷群，吳舊生，趙曉楓，等.豬CAST基因與肌纖維組織學(xué)特性及屠宰性狀的相關(guān)性分析［J］.遺傳，2007，29(1):65 －69.

［22］OUALIA，HERRERA-MENDEZ C H，COULIS G，et al.Revisiting the conversion of muscle into meat and the underlying mechanisms［J］.Meat Science，2006，74:46－48.

［23］SORIMACHI H，ONO Y，SUZUKI K.Skeletal muscle-specific calpain，p94 and connectin/titin:their physiological functions and relationship to limb-girdle muscular dystrophy type 2A［J］.Advances in Experimental Medicine and Biology，2000，481:383－395.

［24］OJIMA K，ONO Y，HATA S，et al.Possible functions of p94 in connectin-mediated signaling pathways in skeletal muscle cells［J］.Journal of Muscle Research and CellMotility，2005，26(6/8):409－417.

［25］KIMBERLY A，HUEBSCH E K，CHRISYINE M W，et al.Mdm muscular dystrophy:interactionswith calpain 3 and a novel functional role for titin’s N2A domain［J］.Human Molecular Genetics，2005，19(14):2801－2811.

［26］MURPHY R M，VERBURH E，LAMB G D.Ca2+activation of diffusible and bound pools ofμ-calpain in rat skeletalmuscle［J］.The Journal of Physiology，2006，576(2):595－612.

［27］沙玉圣，王譚穩(wěn)，楊曉靜，等.半胱胺對(duì)育肥山羊生長(zhǎng)及肌肉嫩度的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(5):1010－1016.

［28］PARR T，SENSKY P L，SCOTHERN G P，et al.Relationship between skeletalmuscle-specific calpain and tenderness of conditioned porcine longissimus muscle［J］.Journal of Animal Science，1999，77:661－668.

Author，ZHANG Yong，professor，E-mail:syndzhy@yahoo.com.cn

(編輯 王智航)

Dietary Protein Level A ffects the Tenderness and P94-NFκB Signaling Pathway of Longissim us Dorsi in Finishing Pigs

ZHANG Yong1CUIYan1TAO Liang1ZHU Yujing1DENG Ke1SUN Cui1SHAO Caimei2
(1.School of Animal Science and Veterinary，Shenyang Agricultural University，Shenyang110866，China;2.Liaoning Wellhope Agri-Tach Co.Ltd.，Shenyang110164，China)

The study was conducted to investigate the effect of dietary ideal protein level on tenderness and mRNA expression levels of P94-NFκB signaling pathway related to proteins and CAST of longissimus dorsi in finishing pigs.Ninety crossbred pigs(Duroc × Landrace × Large white，about 50 kg BW)were random ly allocated into 3 treatments with 3 replicates per treatment and 10 heads per replicate.Pigs in the three treatments were fed dietswith the same energy level and ideal protein levels at12%，16%and 20%，respectively.A ll pigs were slaughtered after 58 days experiment and then muscle samples were collected for the analysis of shear force，meanwhile，mRNA expression levels of P94，NFκB，IκB and CAST of longissimus dorsi in pigs were determ ined by real-time PCR.The results showed as follow s:1)there were significant effects of dietary protein level on shear force and the mRNA expression levels of P94，NFκB，IκB and CAST of longissimus dorsi(P＜0.05);with the increasing of dietary protein level，the shear force and mRNA expression level of IκB and CAST were increased，but that of P94 and NFκB were decreased.2)the shear force was positively correlated with the mRNA expression levels of IκB(coefficient correlation=0.513，P＜ 0.05)and CAST(coefficient correlation=0.816，P＜0.01).3)ThemRNA expression level of CAST was negatively correlated with that of P94(coefficient correlation= －0.496，P＜0.05)，but positively correlated with that of IκB(coefficient correlation=0.710，P＜0.01).4)ThemRNA expression level of P94 was positively correlated with thatof NFκB(coefficient correlation=0.550，P＜0.05)，butnegatively correlated with thatof IκB(coefficient correlation= － 0.518，P＜ 0.05);the mRNA expression levels of IκB and NFκB were negatively correlated(coefficient correlation= －0.539，P＜0.05)to each other.The results indicate that high dietary protein level can increase the shear force and themRNA expression levels of CAST and IκB，but decrease the tenderness and themRNA expression level of P 94;P94-NFκB signaling pathway plays a role in the process of regulating muscle tenderness，but it is not themain pathway.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(8):1342-1350］

protein level;CAST;P 94;NFκB;muscle tenderness

S828

A

1006-267X(2011)08-1342-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.08.013

2011－02－14

國(guó)家自然科學(xué)基金“鈣蛋白酶調(diào)控豬體蛋白降解的信號(hào)途徑研究”(30972112)

張 勇(1972—)，男，甘肅武威人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)與飼料資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail:syndzhy@yahoo.com.cn