張玉貴 (四川省水產(chǎn)學(xué)校合川校區(qū),重慶合川401 520)

胡 波 (四川省水產(chǎn)學(xué)校郫縣校區(qū),四川郫縣611 730)

黃曉莉,汪開(kāi)毓 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院,四川 雅安62501 4)

隨著鱘魚(yú)養(yǎng)殖技術(shù)的普及推廣,我國(guó)的鱘魚(yú)養(yǎng)殖得到快速發(fā)展,鱘魚(yú)養(yǎng)殖品種呈現(xiàn)多樣化,產(chǎn)量也越來(lái)越高,目前已經(jīng)躍居世界第一。筆者在對(duì)四川的鱘魚(yú)養(yǎng)殖基地的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),隨著養(yǎng)殖密度的加大,加之鱘魚(yú)對(duì)于水體溫度的特殊性要求,在養(yǎng)殖過(guò)程中也面臨一些問(wèn)題。鱘魚(yú)疾病也成為一個(gè)不容忽視的問(wèn)題,特別是雜交鱘 (西伯利亞鱘Acipenserbaerii♂×施氏鱘A.schrenckii♀)的體表潰爛現(xiàn)象較為常見(jiàn) (暫定為體表潰瘍病)。為了為該病的診斷、預(yù)防與治療提供依據(jù),筆者對(duì)該病的病原學(xué)和藥物敏感性作了初步研究,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

病魚(yú)為采自四川彭州新興鎮(zhèn)日興特種養(yǎng)殖場(chǎng)所養(yǎng)殖的雜交鱘,每尾體重平均為595.5g。病魚(yú)的體表多處出現(xiàn)明顯的開(kāi)放性潰瘍。健康魚(yú)為購(gòu)自四川鱘魚(yú)養(yǎng)殖基地的健康雜交鱘,每尾體重平均為52.5g。健康魚(yú)飼養(yǎng)在120cm×80cm×50cm的玻璃缸中,飼養(yǎng)采用完全曝氣的自來(lái)水,24h連續(xù)增氧,試驗(yàn)前暫養(yǎng)1周,暫養(yǎng)期間投喂顆粒浮性餌料,試驗(yàn)過(guò)程中不投餌料。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

采用細(xì)菌分離常用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基:普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、胰酪胨大豆瓊脂肉湯 (TSB)、血清肉湯培養(yǎng)基、血清瓊脂平板。

1.1.3 主要試劑

生理鹽水、分子生物學(xué)鑒定試劑、大腸桿菌JM 109、PCR擴(kuò)增的上游引物為5'-GAGCGGATAACAAT TTCACACAGG-3',下游引物為5'-CGCCAGGGTT T TCCCAGTCACGAC-3'、HE染色主要試劑、10%中性福爾馬林固定液、伊紅染液、水乙醇、二甲苯、石蠟、冰醋酸、明礬、氧化汞、中性樹(shù)脂膠、20%戊二醛、20%戊二醛+20%新潔爾滅。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離

取發(fā)病癥狀典型的病魚(yú),用無(wú)菌生理鹽水沖洗病魚(yú)體表,在無(wú)菌條件下,用接種環(huán)分別挑取病魚(yú)潰爛灶邊緣的肌肉,以及病魚(yú)的肝臟、脾臟、腎臟接種TSB肉湯;將接種后的TSB肉湯放入水浴振蕩器中120r/min、28℃下培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況,然后將帶菌肉湯在TSA平板上劃線培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落,顯微鏡鏡檢后進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)[1]。

1.2.2 回歸感染試驗(yàn)

選擇在實(shí)驗(yàn)室水族箱中暫養(yǎng)1周以上的健康雜交鱘,每10尾1組。將分離純化培養(yǎng)的菌株分別接種TSA平板,培養(yǎng)24h后,用無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔,制成3.0×108cfu/ml的菌懸液,分別進(jìn)行注射感染、創(chuàng)傷感染和浸泡感染。其中,注射感染:肌肉注射0.1ml/尾菌懸液,對(duì)照組注射0.1ml/尾的無(wú)菌生理鹽水;創(chuàng)傷感染:將試驗(yàn)魚(yú)體表人為劃破,浸泡在細(xì)菌懸液中,對(duì)照組浸泡于無(wú)菌生理鹽水中,浸泡感染:將體表無(wú)損傷的健康試驗(yàn)魚(yú),浸泡在細(xì)菌懸液中,對(duì)照組浸泡于無(wú)菌生理鹽水中。觀察7d,并記錄試驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的鑒定

(1)病原菌的形態(tài)觀察 單個(gè)菌落接種于TSB肉湯,28℃培養(yǎng)18h后取菌液,經(jīng)涂片、固定和革蘭氏染色,顯微鏡觀察。

(2)生理生化試驗(yàn) 將細(xì)菌接種于 TSA平板和鮮血平板上觀察其菌落形態(tài)和生長(zhǎng)情況,將培養(yǎng)24h斜面上的細(xì)菌采用穿刺發(fā)接種于微生物生化鑒定管中,28℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果[2]。

(3)16S rDNA基因克隆及測(cè)序 分離菌株種的鑒定采用16S rDNA基因特異性擴(kuò)增法進(jìn)行,分別以細(xì)菌核酸提取液和菌細(xì)胞懸液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液,離心收集菌體,提取基因組 DNA。PCR 反應(yīng)體系 (50μ l):5μ l 10 ×buffer,4μ l dNTP,2μ l primer,5μ l模版,4μ l 25nmol Mg2+,0.4μ l Taq酶,加水至 50μ l。PCR反應(yīng)條件:首先 94℃變性 5min,然后進(jìn)入?yún)?shù)為 94℃1min,54℃1min,72℃2min的循環(huán),共30個(gè),最后72℃延伸10min。經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增片段大小應(yīng)在1500bp左右。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化,克隆到pMD18-T載體中后測(cè)序[4]。

(4)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將測(cè)序所得16S rDNA的互補(bǔ)DNA序列,與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知核酸序列進(jìn)行Blast分析,調(diào)出與該序列相關(guān)性較高的核酸序列,采用DNAStar軟件的Multiple Sequence Alignment程序進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建[4]。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

將純化培養(yǎng)24h的細(xì)菌以無(wú)菌生理鹽水洗下,制備成細(xì)菌懸液,取0.1ml菌液涂布于TSA平板。將抗生素紙片 (7mm)貼于平板表面,28℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察其抑菌圈的有無(wú)及直徑大小。根據(jù)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)[5],判斷菌株對(duì)藥物的敏感性結(jié)果 (抑菌圈越大表明敏感性越強(qiáng))。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的大小并作好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

經(jīng)常規(guī)細(xì)菌分離,得到一疑似致病菌株,命名為K070401菌。該菌株在TSA平板上生長(zhǎng)呈邊緣光滑、有光澤的圓形白色菌落,顯微鏡下為革蘭氏陰性短桿菌。該菌葡萄糖氧化發(fā)酵陽(yáng)性,氧化酶檢測(cè)陽(yáng)性,0%NaCl生長(zhǎng),脂酶陽(yáng)性。能利用甘露醇,具運(yùn)動(dòng)性,能發(fā)酵麥芽糖,不產(chǎn)生H2S,葡萄糖產(chǎn)酸陽(yáng)性,葡萄糖產(chǎn)氣陽(yáng)性,精氨酸雙水解酶陽(yáng)性,DNA酶陽(yáng)性,鳥(niǎo)氨酸脫羧陰性,還原硝酸鹽。

2.2 致病菌的動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)

通過(guò)肌肉注射、劃痕浸泡和浸泡感染3種方式對(duì)健康魚(yú)進(jìn)行人工感染,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肌肉注射和劃痕浸泡都能引起試驗(yàn)魚(yú)發(fā)病,而浸泡感染不引起魚(yú)發(fā)病。人工感染24h后可觀察到體表創(chuàng)面面積明顯增大;44h后觀察到潰瘍的出現(xiàn),創(chuàng)面處的皮膚部分脫落,肌肉明顯充血;53h后觀察到潰瘍進(jìn)一步擴(kuò)大,創(chuàng)面處的皮膚幾乎全部脫落,嚴(yán)重充血的肌肉暴露。解剖檢查,腎臟輕微腫大,并可見(jiàn)輕微腸炎,其他臟器無(wú)明顯變化。在無(wú)菌條件下,從人工感染發(fā)病的鱘魚(yú)病灶周?chē)∪夂透闻K中分離到與K070401株形態(tài)與生化特性一致的相同的病原細(xì)菌,表明K070401株是鱘魚(yú)皮膚潰爛病的致病菌病原。

2.3 K070401菌株16Sr DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增出K070401菌株的16S rDNA片段經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)表明,其大小約 1500bp(圖1)。將獲得的序列用DNAstar軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2),結(jié)果表明K070401菌在系統(tǒng)發(fā)育數(shù)上與嗜水氣單胞菌聚為一簇,同源性最高為99.2%(圖3),結(jié)合形態(tài)學(xué)和理化特征鑒定其為嗜水氣單胞菌 (Aeromonashydrophila)。

圖1 分離菌株K070401的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜

圖2 K070401菌株及相關(guān)嗜水氣單胞菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1。由表1可知,磺胺異噁唑、洛美沙星、阿奇霉素的抑菌圈直徑分別為20、22、24mm,表現(xiàn)為高度敏感 (抑菌圈直徑大于20mm);克拉霉素、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、美滿(mǎn)霉素抑菌圈直徑15～18mm,表現(xiàn)為敏感 (抑菌圈直徑大于15mm);氨芐青霉素、萬(wàn)古霉素、阿莫西林無(wú)抑菌圈,表現(xiàn)為不敏感,有耐藥性。

3 小結(jié)

表1 K070401的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

(1)本研究從雜交鱘體表潰瘍旁側(cè)的肌肉分離得到1菌株,革蘭氏染色為陰性,鏡檢下呈短桿狀,兩頭鈍圓,大多數(shù)細(xì)菌單獨(dú)存在,少數(shù)細(xì)菌成對(duì)甚至成鏈存在。菌落 1.5～2.0mm,邊緣光滑,凸起,半透明。該菌葡萄糖氧化發(fā)酵陽(yáng)性,氧化酶檢測(cè)陽(yáng)性,0%NaCl生長(zhǎng),脂酶陽(yáng)性。能利用甘露醇,具運(yùn)動(dòng)性,能發(fā)酵麥芽糖,不產(chǎn)生 H2S,葡萄糖產(chǎn)酸陽(yáng)性,葡萄糖產(chǎn)氣陽(yáng)性,精氨酸雙水解酶陽(yáng)性,DNA酶陽(yáng)性,鳥(niǎo)氨酸脫羧陰性,還原硝酸鹽。K070401株形態(tài)、生化特性與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一致。

(2)應(yīng)用細(xì)菌通用引物,擴(kuò)增出K070401菌株的16SRNA的互補(bǔ)DNA片段,該片段大小為1591bp。經(jīng)與其他細(xì)菌比對(duì),通過(guò)同源性分析比較與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性高達(dá)99.2%,最終鑒定為嗜水氣單胞菌。

(3)通過(guò)動(dòng)物回歸感染試驗(yàn),用分離的菌株獲得相同病灶特征的病魚(yú),可以基本確定K070401菌株是體表潰瘍病的致病菌。

(4)藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌對(duì)羅美沙星、磺胺異噁唑、阿奇霉素敏感;對(duì)克拉霉素、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、美滿(mǎn)霉素較敏感;對(duì)氨芐青霉素、萬(wàn)古霉素、阿莫西林不敏感。該菌不同類(lèi)型的抗生素的敏感性有較大差異,因而在防治該類(lèi)疾病的過(guò)程中要有選擇性。

[1]毛芝娟,劉國(guó)勇,陳昌福,等.大黃魚(yú)潰瘍病致病菌的初步分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,29(2):178-181.

[2]陳雅芳,王 軍,蘇永全,等.養(yǎng)殖石斑魚(yú)潰瘍病病原哈維氏弧菌胞外產(chǎn)物的研究 [J].海洋科學(xué),2006,30(10):30-34.

[3]Weisbnrg W G,Bams S M,Pelletier D A,et al.16S rDNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173:696-703.

[4]陳 償,胡超群,陳曉燕,等.新發(fā)現(xiàn)的紅擬石首魚(yú)潰瘍病病原海藻施萬(wàn)氏菌的分離和分子鑒定[J].海洋與湖沼,2003,34(1):1-8.

[5]蘇秀梅.泥鰍體表潰瘍癥的防治 [J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú),2006,(11):55.