石國勛，鄭祥雄，任天麗

(1無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214002;2福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院)

研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜中破骨細(xì)胞的大量形成是引起RA軟骨和骨破壞的關(guān)鍵因素。破骨細(xì)胞分化刺激因子(ODF)為NF-κB配基受體激活劑，與骨保護(hù)素(OPG)一起是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和活化的重要因子［1］。2005年1月～2006年7月，本實驗用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型模擬人RA的早期臨床表現(xiàn)，研究滑膜中ODF基因表達(dá)與破骨細(xì)胞形成和活化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠20只，雌性，體質(zhì)量為(200±10)g，由上海實驗動物中心提供。Trizol試劑為Gibco公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，完全弗氏佐劑、TRAP染色試劑盒為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 AA大鼠模型的制備 20只SD大鼠隨機(jī)分為兩組各10只，麻醉后一組于右足墊皮下注射完全弗氏佐劑0.1 ml(模型組)，另一組大鼠注射0.1 ml的生理鹽水(對照組)。

1.2.2 滑膜及其關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)檢測 于模型制備后30 d斷頭處死大鼠，分離病變的膝關(guān)節(jié)，經(jīng)脫鈣、脫水，常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色。同樣方法處理對照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織。

1.2.3 滑膜組織總RNA抽提 提取滑膜組織，Trizol試劑盒提取RNA，干燥后用DEPC處理的去離子水50 μl溶解RNA，用核酸紫外分析儀檢測RNA的含量。

1.2.4 RT-PCR 法檢測滑膜中 ODF、OPG、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)基因表達(dá) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。凝膠電泳經(jīng)Fuji Film圖像處理，輸入Image Master VDS凝膠成相系統(tǒng)做灰度掃描，進(jìn)行基因表達(dá)強(qiáng)度分析。結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度比值表示。

1.2.5 滑膜組織破骨細(xì)胞TRAP染色 用TRAP染色試劑盒進(jìn)行組織化學(xué)染色，按說明書進(jìn)行操作。常規(guī)脫水、封片，鏡下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件;實驗數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用成組t檢驗;各指標(biāo)間的關(guān)系用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病變膝關(guān)節(jié)HE染色 致炎30 d后，AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生，滑膜襯里層增厚，滑膜細(xì)胞增生肥大，成絨毛狀排列紊亂，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)突出。在滑膜和軟骨交界處有新生血管翳形成，各種炎性細(xì)胞浸潤，軟骨和骨被破壞。

2.2 ODF、OPG、TRAP基因表達(dá) AA大鼠滑膜組織中ODF mRNA和TRAP mRNA的相對表達(dá)水平分別為0.880 ±0.056 和0.681 ±0.050，而對照組分別為0.109 ±0.013 和0.093 ±0.014，兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P均＜0.01);OPG mRNA對照組和AA組分別為0.231 ±0.051、0.253 ±0.043，兩組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析，TRAP的表達(dá)水平與 ODF/OPG呈正相關(guān)(r=0.932，P＜0.01)。

2.3 滑膜組織破骨細(xì)胞TRAP染色 TRAP染色顯示，在滑膜組織和滑膜—軟骨交界處及侵蝕軟骨表面增生的單個核和多個核且胞質(zhì)內(nèi)有深紅色顆粒沉淀，即為 TRAP陽性的破骨或破骨前提細(xì)胞。Spearman相關(guān)分析表明，AA大鼠病變膝關(guān)節(jié)石蠟切片中TRAP陽性細(xì)胞的數(shù)量與軟骨損傷的程度呈正相關(guān)(r=0.941，P ＜0.01)

3 討論

AA模型是一種免疫炎癥性模型，在臨床和病理上有著與人RA相似的特點，可以作為人類RA較為理想的疾病模型［2］。在病理切片上，AA組大鼠關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜增生，新生血管翳形成，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤、軟組織水腫、關(guān)節(jié)間隙增寬，軟骨和骨破壞，與文獻(xiàn)［3］報道一致，說明AA模型成功，在一定程度上可以反映RA活動期的表現(xiàn)。

目前，對于破骨細(xì)胞的激活和增殖信號傳導(dǎo)有兩個途徑，主要途徑是ODF/RANK/NF-κB或蛋白激酶JAK通路［4］，次要通路是炎癥因子非 ODF/RANK依賴通路。如IL-1、TNF等炎癥因子可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞系分化為有功能的破骨細(xì)胞ODF及其轉(zhuǎn)換受體(RANK)，是腫瘤壞死因子受體超家族成員，具有刺激破骨細(xì)胞前提細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的功能，并可延長其生存時間［5］。OPG是一種分泌性蛋白，是ODF的誘騙受體，和RANK共同競爭與ODF結(jié)合，抑制ODF的生物學(xué)活性。本研究顯示，AA組大鼠滑膜中大量表達(dá)ODF，而在正常組則表達(dá)很少，OPG的表達(dá)兩組則無明顯差別。同時我們也檢測到破骨細(xì)胞的標(biāo)志TRAP的表達(dá)與ODF表達(dá)一致，說明了ODF的表達(dá)與破骨細(xì)胞的形成和活化有關(guān)。

［1］Nakano K，Okada Y，Saito K，et al.Induction of RANKL expression and osteoclast maturation by the binding of fibroblast growth factor 2 to heparan sulfate proteoglycan on rheumatoid synovial fibroblasts［J］.Arthritis Rheum，2004，50(8):2450-2458.

［2］Akiyama T，Mori S，Mashiba T，et al.Incadronate disodium inhibits joint destruction and periarticular bone loss only in the early phase of rat adjuvant-induced arthritis［J］.J Bone Miner Metab，2005，23(4):295-301.

［3］Egan CG，Lockhart JC，F(xiàn)errell WR.Pathophysiology of vascular dysfunction in a rat model of chronic joint inflammation［J］.J Physiol，2004，557(Pt 2):635-643.

［4］Sabokbar A，Kudo O，Athansou NA.Two distinct cellular mechanisms of osteoclast formation and bone resorption in periprosthetic osteolysis［J］.J Orthop Res，2003，21(2):73-81.

［5］Bugress TL，Qian Y，Kaufman S，et al.The ligand for osteoprotegerin directly activates mature osteoclast［J］.J Cell Biol，1999，145(1):527-538.