段新科，繆應(yīng)業(yè)，劉小圓，郭照靜，劉洪強

近年來，真菌感染已成為白血病，淋巴瘤，長期使用免疫抑制、廣譜抗生素，中心靜脈插管，中性粒細胞減少，血液透析，骨髓或器官移植，機械通氣等特殊人群的嚴(yán)重感染性疾病，是醫(yī)院內(nèi)感染的重要部分，抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致真菌的耐藥率逐年上升，病原性酵母菌的藥敏試驗已顯得極其重要。筆者采用ROSCO紙片法和ATBFUNGUS3微量稀釋法，對200株臨床分離的酵母菌做藥敏測試，探討其結(jié)果的一致性、準(zhǔn)確性。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2008-01～06臨床各科室送檢的血液、痰、中段尿、白帶、胸水、腹水等標(biāo)本所分離到的200株酵母菌。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 白色念珠菌ATCC90028，克柔念珠菌ATCC6258，熱帶念珠菌ATCC750。

1.2.2 材料 培養(yǎng)基：沙保氏培養(yǎng)基，法國科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，改良SHADOMY瓊脂，API20C AUX和ATBFUNGUS3均購自鄭州博賽。Rosco藥敏紙片：氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ITC）、酮康唑（KTC）、兩性霉素 B（AMB）、5-氟胞嘧啶（5-FC）、伏立康唑（VOR）購自廣州樂通泰生物科技有限公司。

1.2.3 念珠菌分型 取沙堡氏培養(yǎng)基上已純化的菌落在科瑪嘉 （CHROMAGAR）念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上畫線接種，37℃培養(yǎng)16～24 h，觀察結(jié)果。根據(jù)念珠菌生長菌落在顯色培養(yǎng)基上的顏色進行菌種鑒定，綠色—白念珠菌；藍灰色—熱帶念珠菌；粉紅、白色—克柔或其它念珠菌。其中非白念珠菌全部輔助以API20C AUX生化卡協(xié)助鑒定菌種。

1.2.4 藥敏試驗 Rosco紙片擴散法：接種液濃度為5×105CFU/ml（先配制0.5麥?zhǔn)蠞舛?，再用生理鹽水1∶1稀釋），用無菌棉簽蘸上接種液均勻涂布于SHADOMY瓊脂平皿上，待平皿表面干后，貼上Rosco藥敏紙片，并用標(biāo)準(zhǔn)菌株做質(zhì)控。35℃孵育18～24 h后讀取結(jié)果，如果生長不足再延長至48 h。ATBFUNGUS3微量稀釋法：將菌落混懸無菌鹽水中，使其濃度為2麥?zhǔn)蠁挝?，?0 μl加入ATB培養(yǎng)基中混勻。再以微量加樣器吸取此菌液加入藥敏板中，每孔135 μl，蓋上塑料蓋，置35℃孵育24～48 h。以生長對照孔生長良好，而含藥最高稀釋孔不生長者為最小抑菌濃度的終點。

1.2.5 藥敏結(jié)果判斷 根據(jù)丹麥Rosco公司制定NeoSensitab抗真菌藥紙片法及其判讀標(biāo)準(zhǔn)，ATBFUNGUS3說明書進行判讀。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS12.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 念珠菌屬的分布 其中白色念珠菌120株、熱帶念珠菌37株、光滑念珠菌30株、克柔念珠菌7株、近平滑念珠菌6株。

2.2 藥敏結(jié)果分析 藥敏試驗結(jié)果都在質(zhì)控范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)。Rosco紙片擴散法與ATBFUNGUS3微量稀釋法相符率分別為：FCZ 為 97.22%（175/180）；ITC 為 97.82%（180/184）；KTC 為 97.82%（181/185）；AMB 為 100%（198/198）；5-FC 為96.87%（155/160）；VOR 為 100%（192/192）。 經(jīng)配對 χ2檢驗，無顯著性差異（P>0.05）。

3 討 論

念珠菌廣泛存在于自然界，并寄生于人體皮膚和黏膜，屬于條件致病菌。隨著大量廣譜抗生素的應(yīng)用，糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，使條件致病真菌的感染呈上升趨勢，隨著真菌感染發(fā)病率的不斷上升，真菌病的治療也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，且有關(guān)耐藥菌株的報道也逐漸增多。據(jù)文獻報道：念珠菌血癥已占醫(yī)院獲得性血液感染的第四位[1]；另一份報道指出20世紀(jì)90年代初和80年代相比，念珠菌病的發(fā)生率由每年的每百萬分之2.6增至72.8[2]；真菌體外藥敏試驗也越來越顯得重要，這也是臨床上用以評價藥物敏感性最基本的方法之一。

NCCLS推薦的紙片擴散法操作簡便易行，可常規(guī)開展，自頒布以來，大量實驗室采用此方法檢測氟康唑的耐藥性，但此法檢測藥物單一，臨床醫(yī)師迫切需要其它抗真菌藥物的體外藥敏試驗，如伊曲康唑、兩性霉素B等，所以實驗室需要更適合臨床需要的體外抗真菌藥敏試驗。ATBFUNGUS3是法國生物梅里埃公司的產(chǎn)品，手工操作簡便，能檢測常用抗真菌藥物，只要嚴(yán)格按照規(guī)程操作，可得到較為準(zhǔn)確的MIC值，但成本相對較高。ROSCO藥敏紙片是丹麥ROSCO公司生產(chǎn)的專用于擴散法的紙片，克服了唑類藥物擴散性差的缺點，紙片直徑9.2 mm，該法操作簡便、結(jié)果易判讀，在國外尤其是歐洲被廣泛應(yīng)用于臨床實驗室[3]，國內(nèi)也有實驗室采用[4，5]。

筆者選用ATBFUNGUS3和ROSCO紙片擴散法，檢測200 株酵母對 FCZ、ITC、KTC、AMB、5-FC、VOR 的耐藥性。結(jié)果表明，ATBFUNGUS3和ROSCO紙片擴散法相比有較高的符合率，F(xiàn)CZ 為 97.22%（175/180）；ITC 為 97.82%（180/184）；KTC 為 97.82%（181/185）；AMB 為 100%（198/198）；5-FC 為96.87%（155/160）；VOR 為 100%（192/192）。 經(jīng)配對 χ2檢驗，兩種方法無顯著性差異（P>0.05）。

綜上所述，Rosco公司的Neo-Sensitab抗真菌藥紙片法操作簡便、觀察時間短、成本低廉，有較高準(zhǔn)確性，能及時的為臨床提供抗真菌藥物相關(guān)信息，是值得在臨床上推廣的一種藥敏試驗篩選方法；從而為廣大實驗室選擇準(zhǔn)確、快速、易于常規(guī)開展的抗真菌體外藥敏試驗提供實驗依據(jù)。

[1]Groll AH，Shah PM，Mentzel C，et al.Trends in the postmoreten epidemiology of invasive fungel infections at a university hospital[J].J Infect，1996，33（1）:23.

[2]Beck-Sague C，Jarvis WR.Secular trends in the epidemiology of nosocomial fungal infections in the United States 1980-1990.National Nosocomial Surveillance System[J].J Infect Dis，1993，167（5）：1247.

[3]Vandenbossche I，Vaneechoutte M，Vandevenne M，et al.Susceptibility testing of fluconazole by the NCCLS broth macrodilution method，E-test，and disk diffusion for application in the rounte laboratory[J].J Clin Microbiol，2002，40:918.

[4]金 蘭，蔣新良，張 嶸.Rosco紙片擴散法檢測酵母樣真菌對氟康唑藥敏試驗的評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)，2004，27:46.

[5]俞蓮花，王冬國，吳大康.72株念珠菌ROSCO紙片擴散法的耐藥性分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2004，14:92.