鄧林強(qiáng)，陳 會(huì)，郭建軍，孫 敬，余理智，熊章華

(1.江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、浙江臺(tái)州骨傷醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 317500)

100株肺炎鏈球菌耐藥性分析

鄧林強(qiáng)1，陳 會(huì)1，郭建軍2，孫 敬1，余理智1，熊章華1

(1.江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、浙江臺(tái)州骨傷醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 317500)

目的了解肺炎鏈球菌耐藥情況和β-內(nèi)酰胺類抗生素MIC濃度檢測(cè)的意義。方法對(duì)我院收治的社區(qū)獲得性肺炎患者中呼吸道標(biāo)本分離出的100株肺炎鏈球菌進(jìn)行7種抗菌藥物MIC濃度檢測(cè)和苯唑西林 (OX)的K-B法檢測(cè)。結(jié)果①100株肺炎鏈球菌中，耐青霉素肺炎鏈球菌占13%；頭孢噻肟和左旋氧氟沙星的耐藥率都為6%；對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥率分別為84%、80%和88%；對(duì)萬(wàn)古霉素則全敏感。②K-B法檢測(cè)出苯唑西林敏感59株(占59%)。 結(jié)論 本院收治的社區(qū)獲得性肺炎患者中的肺炎鏈球菌對(duì)部分抗生素耐藥性比較嚴(yán)重，但青霉素仍具有較好的體外抗菌活性。且β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行MIC濃度測(cè)定是有必要的。

肺炎鏈球菌；耐藥率；苯唑西林；MIC

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，具有很高的發(fā)病率和病死率(尤其是老人和兒童)。在發(fā)展中國(guó)家，每年有500萬(wàn)5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎，10～50萬(wàn)兒童死于肺炎鏈球菌引起的腦膜炎[1]。近年來(lái)肺炎鏈球菌引起的呼吸道感染已被列為研究重點(diǎn)之一[2]，耐藥率也逐年上升。為了解肺炎鏈球菌耐藥情況,現(xiàn)將我院2009年1月至2010年12月期間收治的社區(qū)獲得性肺炎患者呼吸道標(biāo)本中分離出的100株肺炎鏈球菌的耐藥性進(jìn)行分析,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 100株肺炎鏈球菌為我院2009年1月至2010年12月收治的社區(qū)獲得性肺炎患者標(biāo)本中分離菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基、藥敏紙片和試劑 MH瓊脂粉、苯唑西林(OX)紙片和 Optochin紙片(5μg/片)購(gòu)自 OXOID公司(英國(guó))。5%羊血瓊脂平板為本實(shí)驗(yàn)室自制。肺炎鏈球菌鑒定及藥敏鑒定卡購(gòu)自BD公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與鑒定

1.2.1.1 標(biāo)本接種按操作規(guī)程[3]進(jìn)行，標(biāo)本直接涂片：①WBC大于25個(gè)/LP，EPC小于10個(gè)/LP；②見G+雙球菌，呈“矛頭狀”或“瓜子仁”狀排列；③WBC吞噬或伴行G+雙球菌。將接種了標(biāo)本的平皿置6%CO2孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。分離菌株經(jīng)革蘭染色后，用BD公司的鏈球菌鑒定與藥敏卡進(jìn)行鑒定和MIC濃度測(cè)定。

1.2.1.2 Optochin敏感性試驗(yàn) 配制0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?用無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻涂抹于含5%羊血MH瓊脂平板，10min后貼Optochin紙片一片,將平皿置35℃、6%CO2孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。抑菌環(huán)直徑≥14mm為敏感。

1.2.1.3 膽汁溶解試驗(yàn)(試管法)分別取1ml 6麥?zhǔn)蠁挝痪河?只試管中，于一管菌液中加0.1ml 10%去氧膽酸鈉溶液,另一管中加0.1ml無(wú)菌生理鹽水，混勻后，置35℃孵箱15min取出，搖勻后觀察結(jié)果。加鹽水管菌液濁度不變，加去氧膽酸鈉溶液管菌液變澄清，判為膽汁溶解試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.2.1.4 分子生物學(xué)鑒定 從待測(cè)菌中提取自溶素(lytA)基因并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行BsaAI酶切。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(75V，60min)，溴化乙錠(EB)染色，紫外燈下觀察，結(jié)合DNA Marker判斷若出現(xiàn)761bp、452bp兩條帶即為典型的肺炎鏈球菌lytA基因。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)方法 OX藥物敏感試驗(yàn)和Optochin敏感性試驗(yàn)采用CLSI2010版推薦的紙片擴(kuò)散法(KB法)進(jìn)行；其他藥物的MIC濃度由BD Phoenix 100檢測(cè)；并根據(jù)CLSI 2010年版判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判斷。

1.3 質(zhì)控菌株 以上材料與方法所需用的質(zhì)控菌株分別為金黃色葡萄球菌ATCC 25923和肺炎鏈球菌ATCC 49619。

2 結(jié)果

2.1 我院2009年1月至2010年12月收治的社區(qū)獲得性肺炎患者標(biāo)本中分離出的100株肺炎鏈球菌，耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP，MIC≥8μg/ml)13株(占 13%)，中介(PISP)8 株(占 8%)，敏感(PSSP)79 株(占79%)；頭孢噻肟和左旋氧氟沙星的耐藥株都為6株(占6%)；對(duì)頭孢噻肟中介的肺炎鏈球菌有4株(占4%)，而對(duì)左旋氧氟沙星中介株為1株(占1%)；對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素耐藥率比較高，分別為84%、80%和88%；對(duì)萬(wàn)古霉素則全敏感。

2.2 100株肺炎鏈球菌經(jīng)紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定，OX敏感(抑菌圈≥20mm)59株(占59%)。OX抑菌圈直徑≤19mm的41株肺炎鏈球菌(經(jīng)MIC測(cè)定)對(duì)青霉素耐藥 13株(占 31.71%)、中介 8株(占 19.51%)、敏感20株 (占48.78%)；對(duì)頭孢噻肟耐藥6株 (占14.63)、 中介4株 (占9.76%)和敏感31株 (占75.61%)。

2.3 100株肺炎鏈球菌如以CLSI 2008版以前的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判斷，青霉素和頭孢噻肟的耐藥率將大大增加。其中青霉素的耐藥率為33%，而頭孢噻肟的耐藥率為13%。

3 討論

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性感染的重要病原菌，自1967年澳大利亞Hansman等[4]首次分離出青霉素不敏感肺炎鏈球菌(PNSSP)以來(lái)，PNSSP在世界范圍內(nèi)迅速傳播，近年來(lái)耐藥率迅速升高。實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)青霉素及其它β內(nèi)酰胺類抗生素藥敏時(shí)，由于還沒(méi)有可靠的紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)，因此，用OX代替青霉素及其它β-內(nèi)酰胺類抗生素。即當(dāng)OX抑菌圈≥20mm的肺炎鏈球菌分離株對(duì)青霉素敏感。當(dāng)OX抑菌圈直徑≤19mm時(shí)，就應(yīng)檢測(cè)青霉素和頭孢噻肟的MIC值[5，6]。而本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示OX敏感59株。41株OX抑菌圈直徑≤19mm的肺炎鏈球菌經(jīng)MIC測(cè)定，對(duì)青霉素和頭孢噻肟耐藥僅分別為13株(占 31.71%)和 6 株(占 14.63)。

2008 年以前美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)公布的 《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》(即CLSI 2008及以前版本)判定肺炎鏈球菌對(duì)青霉素最低抑菌濃度(MIC)的標(biāo)準(zhǔn)為：≤0.06μg/ml為敏感[5]。CLSI 2009及以后版本對(duì)此進(jìn)行了修改，標(biāo)準(zhǔn)改為：非腦膜炎時(shí)≤2μg/ml為敏感，4μg/ml為中介，≥8μg/ml為耐藥；腦膜炎時(shí)≤0.06μg/ml為敏感，≥0.12μg/ml為耐藥(沒(méi)有中介)[6]。判斷標(biāo)準(zhǔn)的改變就使得社區(qū)獲得性肺炎中分離出的肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的敏感率大幅升高。這也就是本文中青霉素的耐藥率由33%降低到的13%，并出現(xiàn)8%中介的原因之一。頭孢噻肟的耐藥率降低也可能是出于此。

試驗(yàn)中所分離出的100株肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素、克林霉素和四環(huán)素呈高水平耐藥，其中對(duì)紅霉素的耐藥率為84%(84株)，對(duì)克林霉素的耐藥率為80%(80株)，對(duì)四環(huán)素的耐藥率為88%(88株)，這與國(guó)內(nèi)的報(bào)道相近[7-10]。其耐藥機(jī)制可能與erm基因介導(dǎo)核糖體靶位修飾、mef基因介導(dǎo)的主動(dòng)外排機(jī)制和50S核糖體突變有關(guān)。肺炎鏈球菌對(duì)左旋氧氟沙星和萬(wàn)古霉素都很敏感，萬(wàn)古霉素的敏感率達(dá)到100%。

綜上所述，本院收治的社區(qū)獲得性肺炎患者中的肺炎鏈球菌對(duì)部分抗生素耐藥性比較嚴(yán)重，但青霉素仍具有較好的體外抗菌活性。

[1]李 杰,俞桑潔,楊永弘.肺炎鏈球菌疾病及其預(yù)防[J].中國(guó)計(jì)劃免疫,1999,5(3):176-179.

[2]陳慧中.中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一屆兒科學(xué)會(huì)各學(xué)科組總結(jié)[J].中華兒科雜志,1998,36(4):196-197.

[3]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].第3版,南京:東南大學(xué)出版社,2006:744-745.

[4]Hansman D,Bullen MM.A resistant pneumococcus[J].Lancet,1967,2(7295):264-265.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;20th informational supplement[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008:M100-S18.

[6]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;20th informational supplement[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2010:M100-S20.

[7]樊 有,丁晶晶,施 毅,等.南京地區(qū)肺炎鏈球菌耐藥情況分析[J].中國(guó)感染與化療雜志,2008,8(5):383-386.

[8]付方俊.92株肺炎鏈球菌的耐藥分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生雜志,2011,49(3):111-112.

[9]張 曦.204株肺炎鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].中國(guó)醫(yī)藥指南雜志,2010,8(26):15-17.

[10]胡曉彥,賈坤如,胡龍華,等.肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的耐藥性分析[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2007,25(6):551-552.

R378.1+4,R446.5,Q939.92

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1674-1129(2011)06-0633-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.06.021

江西省衛(wèi)生廳課題，編號(hào)：20070324