接本刊2011年第1期

5 乳中的嗜冷菌和耐熱菌

5.1 嗜冷菌

奶牛場(chǎng)和乳品企業(yè)常用冷藏和有效的衛(wèi)生清洗消毒的方法來(lái)控制微生物對(duì)產(chǎn)品的污染，以保證生乳和產(chǎn)品的質(zhì)量。但在實(shí)際生產(chǎn)中微生物的污染是不可避免的，因此，收集生乳的過(guò)程同時(shí)也是聚集微生物的過(guò)程，特別是嗜冷菌。

嗜冷菌是指那些能在低于7 ℃條件下生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌，雖然其理想生長(zhǎng)溫度為20～30 ℃，但在冷藏溫度下仍可生長(zhǎng)。這類細(xì)菌大多數(shù)可被巴氏殺菌殺死，但菌體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的胞外酶卻具有抗熱性，可以在巴氏殺菌乳中保留其酶活性，進(jìn)而因酶的作用影響生乳和最終產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量。因此，控制微生物污染及有效抑制其在乳制品中的生長(zhǎng)是提高和改善低溫冷藏產(chǎn)品的關(guān)鍵。

5.1.1 嗜冷菌的種類

乳制品中最常見(jiàn)的嗜冷菌是革蘭氏陰性桿菌（GNRS），其中假單胞菌約占其總數(shù)的50%，而熒光假單胞菌又是主要的優(yōu)勢(shì)菌種。此外，還有其它一些革蘭氏陰性桿菌和某些可產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿菌可在低于7 ℃下生長(zhǎng)，如嗜冷性革蘭氏陰性桿菌，其中包括黃桿菌、產(chǎn)堿桿菌和色桿菌屬等。

（1） 假單胞菌

假單胞菌是呈直的或彎曲狀的桿菌，需氧，不發(fā)酵糖，觸酶陽(yáng)性，大多菌株氧化酶陽(yáng)性，可產(chǎn)生擴(kuò)散性熒光物質(zhì)。主要見(jiàn)于土壤和水中。乳制品中假單胞菌的污染來(lái)源主要有下面3種情況。

一是擠乳和儲(chǔ)乳設(shè)備。表面清洗不徹底的擠乳和儲(chǔ)乳設(shè)備是乳制品中假單胞菌的主要污染來(lái)源。因?yàn)橥寥篮退械木w可在設(shè)備空隙、連接處、橡膠墊及清洗差的死角處殘留的污垢中生長(zhǎng)繁殖，因此，有效的衛(wèi)生制度和清洗消毒措施、消毒用軟水等是控制污染的有效辦法。如送乳管道、攪拌器、水位量尺、出口、栓塞、旋塞閥等附屬設(shè)備因難以清洗干凈而可能成為污染源。牛場(chǎng)擠出的生乳應(yīng)盡快送到加工廠加工處理，因?yàn)樵谌楣拗械蜏貎?chǔ)藏會(huì)使嗜冷菌不斷生長(zhǎng)繁殖。如在7 ℃儲(chǔ)藏了3 天的乳樣中，假單胞菌比新鮮生乳中的菌數(shù)高10 倍，而蛋白酶活力高1 000 倍，脂肪酶高280 倍。

二是運(yùn)輸和加工廠儲(chǔ)藏中的污染。一般采用密封罐車或冷藏車來(lái)運(yùn)輸生乳。要徹底清洗罐車，防止在車罐內(nèi)壁形成乳膜污垢而滋生微生物（特別是嗜冷菌），成為污染源。乳罐車清洗的關(guān)鍵部位有：空氣呼吸器、過(guò)濾網(wǎng)、就地清洗系統(tǒng)（CIP）的噴頭等。在運(yùn)輸過(guò)程中嗜冷菌常會(huì)增長(zhǎng)2 倍，到達(dá)加工廠的菌數(shù)取決于原始菌數(shù)和運(yùn)輸旅程的長(zhǎng)短。控制原始污染量是降低菌數(shù)的關(guān)鍵。奶倉(cāng)的菌種主要是嗜冷菌，其中絕大多數(shù)是假單胞菌，占70.2%，腸細(xì)菌占7.7%，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為6.9%，還有革蘭氏陰性菌、桿狀菌等。在6 ℃下儲(chǔ)藏48 h的生乳，菌數(shù)可繁殖2 個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。如原來(lái)菌數(shù)為1.3×105CFU/mL，則此時(shí)的菌數(shù)即可變?yōu)?.3×107CFU/mL。在假單胞菌中，各菌的檢出頻率為：熒光假單胞菌I型為32.1%，莓實(shí)假單胞菌為29.6%，熒光假單胞菌Ⅲ型為17.3%，隆德假單胞菌為19.8%。

三是巴氏殺菌后污染。盡管生乳中的革蘭氏陰性菌、嗜冷菌不能耐受巴氏殺菌，但從巴氏殺菌乳和稀奶油中常常能分離出嗜冷菌，特別是假單胞菌，這主要是殺菌后的二次污染。產(chǎn)品的保質(zhì)期受殺菌后污染程度的制約。試驗(yàn)表明，短保質(zhì)期（4～6 ℃，≤5 天）分離的菌體幾乎都是假單胞菌（90.7%以上），而較長(zhǎng)保質(zhì)期（4～6 ℃，≥10 天）的乳樣中則含有芽孢桿菌、假單胞菌等。乳品企業(yè)的假單胞菌污染有多種來(lái)源，而設(shè)備管道內(nèi)壁和墊圈等因未清洗干凈滋生微生物所形成的菌生物膜是最重要的污染源。從電子顯微鏡上可以看出菌膜上吸附生長(zhǎng)的菌體，特別是假單胞菌的粘附能力較強(qiáng)，且在膜上易于生長(zhǎng)。因此，嚴(yán)格的衛(wèi)生清洗制度和有效的清洗消毒措施是降低微生物污染的有效辦法。

許多事實(shí)證明，產(chǎn)品的灌裝設(shè)備和技術(shù)是影響巴氏殺菌乳貨架期的又一重要環(huán)節(jié)，科學(xué)合理地設(shè)計(jì)灌裝機(jī)和工藝可極大地改善產(chǎn)品品質(zhì)和貨架期，如無(wú)菌包裝的巴氏殺菌乳在3 ℃下的貨架期有時(shí)可達(dá)到7 天。

（2） 其它嗜冷菌

從生乳、巴氏殺菌乳和奶油中還可分離出可在低于7 ℃條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌，如產(chǎn)堿桿菌和色桿菌等。商業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)被一定微生物污染的生乳進(jìn)行高溫短時(shí)巴氏殺菌（HTST：72 ℃，15 s）是可以基本將嗜冷性假單胞菌殺死的。但是，實(shí)驗(yàn)室巴氏殺菌、無(wú)菌包裝、保證無(wú)任何后污染的乳制品和奶油儲(chǔ)存在低溫下，甚至在1 ℃下，仍會(huì)發(fā)生微生物性的變質(zhì)腐敗。這是由能生成芽孢的菌核需氧芽孢菌引起的，如果要避免這種現(xiàn)象，除非進(jìn)行無(wú)菌擠乳。即使高質(zhì)量的生乳仍含有幾千個(gè)細(xì)菌，其中一半為棒狀桿菌和微球菌。據(jù)報(bào)道，嗜冷性假單胞菌和熱不穩(wěn)定革蘭氏陰性嗜冷菌，如黃桿菌、產(chǎn)堿桿菌、色桿菌等，通常是優(yōu)質(zhì)生乳微生物菌群的小部分菌群。棒狀桿菌、微球菌、節(jié)桿菌、鏈球菌通常既是嗜冷菌又是耐熱菌，這些菌體和需氧、厭氧芽孢菌可耐受HTST處理。生乳中的芽孢菌數(shù)變化較大，但其污染菌數(shù)一般不超過(guò)總菌數(shù)的2%。

嗜冷型芽孢桿菌在15 ℃時(shí)表現(xiàn)出最大的出芽活性，在5 ℃時(shí)可能出現(xiàn)第2個(gè)出芽高峰。升高巴氏殺菌乳的殺菌溫度對(duì)保證質(zhì)量有副作用，因?yàn)楦哂?2 ℃可能誘導(dǎo)芽孢出芽。在發(fā)酵乳產(chǎn)酸未達(dá)到足以抑制芽孢生長(zhǎng)的pH值之前，芽孢桿菌的生長(zhǎng)和出芽較快。嗜冷酵母菌和霉菌也可引起酸奶的變質(zhì)。

5.1.2 嗜冷性致病菌

單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏細(xì)菌、蠟狀芽孢桿菌和出血性大腸桿菌等是嗜冷性致病菌，可以在8 ℃或低于8 ℃下生長(zhǎng)，但只有蠟狀芽孢桿菌是影響巴氏殺菌乳和新鮮乳制品貨架期的主要因素。嗜冷菌的蛋白質(zhì)水解可促進(jìn)致病菌的生長(zhǎng)。嗜冷菌污染乳制品的可能性一般有以下兩個(gè)方面。

一是乳制品受需氧芽孢桿菌的污染幾率受季節(jié)的影響，一般在夏末、秋初污染量最大。乳腺上粘附的墊草、土壤是造成芽孢桿菌數(shù)高的主要原因。生乳中污染的芽孢桿菌常見(jiàn)的有蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌。不同的乳品企業(yè)或同一企業(yè)不同時(shí)期從新鮮巴氏殺菌乳中分離出的芽孢桿菌數(shù)差異較大。

二是污染生乳的嗜冷型芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)品的變質(zhì)作用，可通過(guò)將沒(méi)有后污染的產(chǎn)品在適宜的條件下培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般在3 ℃下放置約7 周后即發(fā)生變質(zhì)。無(wú)后污染的巴氏殺菌產(chǎn)品在7～10 ℃下的保質(zhì)期比出現(xiàn)后污染的相應(yīng)產(chǎn)品在3～5 ℃下的保質(zhì)期長(zhǎng)3倍。生乳是嗜冷性芽孢桿菌的主要污染來(lái)源，而非殺菌后污染。在生乳和巴氏殺菌乳中環(huán)狀芽孢桿菌菌數(shù)低于蠟狀芽孢桿菌，在12 ℃下變質(zhì)時(shí)主要優(yōu)勢(shì)菌是蠟狀芽孢桿菌、棒狀桿菌、微球菌和鏈球菌等。嗜冷菌在非無(wú)菌包裝的巴氏殺菌產(chǎn)品中的污染菌主要是革蘭氏陰性菌，特別是假單胞菌。

5.1.3 嗜冷菌胞外酶

嗜冷菌不僅可在生乳中生長(zhǎng)，還可釋放出許多可降解乳成分的胞外酶，包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酯酶、胞外多肽酶、糖酶。通常情況下，其分泌的胞外酶可耐受巴氏殺菌溫度（70～80 ℃），甚至超高溫（120～140 ℃）。嗜冷菌的代表菌株——假單胞菌分泌的蛋白酶和脂肪酶活性為60%～70%；在140 ℃下加熱5 s后，可殘留酶活性30%～40%。這些酶的耐熱特性也因受到如蛋白質(zhì)保護(hù)的影響而提高了穩(wěn)定性。

假單胞菌的多數(shù)蛋白酶是金屬蛋白酶，一些假單胞菌可產(chǎn)生多種蛋白酶。大多數(shù)蛋白酶具有凝乳特性，可降解κ-酪蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白，對(duì)未變性乳清蛋白的酶解活性較低。酶反應(yīng)溫度為30～50 ℃，在高出理想溫度時(shí)酶活性急速下降，另外，大量文獻(xiàn)報(bào)道，所有蛋白酶在低溫4 ℃下仍可保留活性。熒光假單胞菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性較高，相反地其它大多數(shù)蛋白酶在60 ℃左右穩(wěn)定性較差。酶的熱穩(wěn)定性對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有較大影響，因?yàn)樵诎褪蠚⒕楹蚒HT乳中耐熱蛋白酶會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的變質(zhì)（如苦味、酸味等）。

（2）脂肪酶

乳中脂肪水解不如蛋白質(zhì)水解明顯，從熒光假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶與脂肪結(jié)合或形成脂肪酶多糖復(fù)合物。一般認(rèn)為，假單胞菌只產(chǎn)生一種脂肪酶，主要對(duì)乳脂肪有典型的表現(xiàn)活力。乳中發(fā)現(xiàn)的最重要的脂肪酶是磷脂酰膽堿酶，即磷脂肪酶，可水解乳脂肪膜導(dǎo)致脂肪釋放并聚集，使脂肪更易被乳源性脂肪酶水解。熒光假單胞菌脂肪酶的理想pH值為7～8。然而，在pH值在5～11的范圍內(nèi)菌可保持酶活力，酶反應(yīng)溫度為22～25 ℃，但也發(fā)現(xiàn)在-29 ℃下酶仍有活力。大多數(shù)脂肪酶分子質(zhì)量為32～633 ku。脂肪酶在130 ℃殺菌溫度下仍保留活力，熒光假單胞菌脂肪酶可耐受巴氏殺菌和UHT殺菌而殘留酶活性并進(jìn)而影響產(chǎn)品的存儲(chǔ)質(zhì)量。

（3）其它酶類

除蛋白酶和脂肪酶外，還有其它一些胞外酶進(jìn)入乳中，在此暫不詳述。

5.1.4 嗜冷菌對(duì)乳與乳制品的影響

一般來(lái)說(shuō)，巴氏殺菌乳和UHT乳的保質(zhì)期質(zhì)量受其含有的蛋白酶、脂肪酶活動(dòng)的影響。當(dāng)生乳在UHT殺菌前乳中的嗜冷菌菌數(shù)達(dá)到6log CFU/mL時(shí)，殺菌后不出20 周即發(fā)生凝膠化（凍化）；若菌數(shù)在6.9～7.2log CFU/mL，在2～10 周將發(fā)生凝膠，并逐漸產(chǎn)生不新鮮風(fēng)味或苦味。

干酪會(huì)受到蛋白酶和脂肪酶的影響，并產(chǎn)生不良變化，如產(chǎn)量降低，風(fēng)味缺陷，酸敗以及產(chǎn)生肥皂味等。蛋白酶對(duì)干酪的副作用較小，脂肪酶卻通過(guò)與脂肪等物質(zhì)的結(jié)合而保留在干酪中，因此，由脂肪酶引起的風(fēng)味缺陷要大。過(guò)度的脂肪水解可導(dǎo)致不良風(fēng)味的出現(xiàn)，通常生乳中嗜冷菌菌數(shù)在7.5～8.3log CFU/mL時(shí)即可發(fā)生該缺陷。

奶油受到耐熱脂肪酶的作用也會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)?shù)乃馑釘?，其結(jié)果是由于奶油水滴相中假單胞菌生長(zhǎng)而產(chǎn)生酸敗或腐敗氣味。奶油對(duì)嗜冷菌脂肪酶敏感，風(fēng)味不良是嗜冷菌在奶油中繁殖導(dǎo)致的主要缺陷。

從目前的大學(xué)生就業(yè)形勢(shì)來(lái)看，就業(yè)形勢(shì)嚴(yán)峻并不是工作崗位少，而是工作崗位的匹配度不高，市場(chǎng)上所需的人員和職業(yè)，市場(chǎng)營(yíng)銷占據(jù)了大多數(shù)。但大學(xué)生的就業(yè)觀念還是停留在傳統(tǒng)的觀念上，認(rèn)為政府機(jī)關(guān)、國(guó)企、銀行、大公司、外資企業(yè)的職業(yè)是金飯碗，希望到這類地方就業(yè)，可是，大學(xué)生喜歡的就業(yè)部門(mén)都存在不同程度的減員增效和機(jī)構(gòu)合并，崗位十分有限，相比之下就顯得就業(yè)難度較大。此外，由于大學(xué)生剛出校門(mén)，沒(méi)有技術(shù)經(jīng)驗(yàn)和資金積累，要想進(jìn)行創(chuàng)業(yè)就要突破許多障礙，但難度較大，成功率較低。即使成功后，由于門(mén)檻低、技術(shù)性不強(qiáng)等原因也會(huì)被市場(chǎng)淘汰。

用被嗜冷菌污染嚴(yán)重的生乳去生產(chǎn)酸牛乳和發(fā)酵制品也會(huì)出現(xiàn)不良風(fēng)味、苦味、不潔味或水果味等缺陷。

由上可見(jiàn)，在加熱前，嗜冷菌的生長(zhǎng)或其存在將對(duì)終產(chǎn)品產(chǎn)生顯著的副作用。巴氏殺菌后二次污染的假單胞菌雖然菌數(shù)較低，但其對(duì)產(chǎn)品保質(zhì)期的影響要大于生乳中菌數(shù)的影響。

眾所周知，徹底杜絕假單胞菌之類的嗜冷菌的污染幾乎是不可能的，因此同時(shí)采取限制酶的釋放的方法比單純控制污染更有效。從理論上講，常用的既控制污染又抑制酶產(chǎn)生的方法有：加熱處理（60～66 ℃，5～20 s），添加添加劑（CO2、N2），高壓處理，微生物拮抗作用，提高乳中過(guò)氧化物酶體系的活性，添加水解酶抑制劑，加入產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，低溫滅活酶等。必須指出的是，上述方法的應(yīng)用必須建立在符合我國(guó)法律法規(guī)的前提下。在我國(guó)乳制品工業(yè)中應(yīng)用最多的是加熱處理來(lái)滅活細(xì)菌。

5.2 耐熱菌

所謂耐熱菌是指在實(shí)驗(yàn)型巴氏殺菌溫度下可以存活的菌體。乳酸細(xì)菌、芽孢桿菌通?？?00%存活；一些微球菌的耐熱性差；產(chǎn)堿桿菌僅有1%～10%存活；鏈球菌、乳桿菌和一些棒狀桿菌是耐熱菌，可在60 ℃下耐受20 min，但僅有1%左右的菌株可耐受63 ℃、30 min的條件。

5.2.1 芽孢桿菌屬

芽孢桿菌屬是乳中污染的主要的耐熱菌種。常見(jiàn)于乳中的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌，其中重要的芽孢桿菌是蠟狀芽孢桿菌。該類菌種為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，需氧，內(nèi)生芽孢，可胨化生乳。除上述特性外，該菌大多數(shù)的菌株可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和磷脂酰膽堿酶，可發(fā)酵葡萄糖、果糖、海藻糖、N-乙酰葡糖胺、麥芽糖等；一般在5～6 ℃下仍可生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃，最高生長(zhǎng)溫度為37～48 ℃；最低生長(zhǎng)pH值為4.3，最高為9.3。盡管該菌在有氧條件下生長(zhǎng)良好，但也可在厭氧條件下通過(guò)發(fā)酵葡糖糖和還原硝酸鹽呼吸而生長(zhǎng)。

形成芽孢是一個(gè)復(fù)雜和耗時(shí)較長(zhǎng)的過(guò)程，一般發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期和穩(wěn)定早期。即使在理想狀態(tài)下形成芽孢仍需6～24 h。在冷藏條件下不會(huì)形成芽孢，但當(dāng)菌體生長(zhǎng)耗盡營(yíng)養(yǎng)時(shí)可形成芽孢。在乳制品設(shè)備管道上殘留的稀釋乳成分可形成薄膜，并產(chǎn)生芽孢。

芽孢的出芽要快于成孢，發(fā)芽率依賴于環(huán)境溫度，在適宜溫度下發(fā)芽不需要1 h即可完成。在乳制品加工中，高溫短時(shí)的巴氏殺菌熱處理可激活芽孢發(fā)芽。芽孢被激活后，又因加熱處理而在乳中形成刺激出芽的物質(zhì)，提高芽孢的出芽率。芽孢菌耐熱性因菌株不同而有差異，盡管芽孢不被HTST殺死，但UHT可將其殺滅。其典型的D100 ℃（熱致死時(shí)間）為0.3～10 min，而嗜熱脂肪芽孢桿菌的D100 ℃為3 000 min，但芽孢桿菌的滋養(yǎng)體或繁殖體較易被巴氏殺菌滅活。

蠟狀芽孢桿菌是許多食品的污染菌種，可引起人的食物中毒。當(dāng)人體攝入含有大量活菌的食品時(shí)即可能引起以嘔吐、腹瀉、腸絞痛為主要癥狀的食物中毒。一般在食品中含有105～108個(gè)/g活菌時(shí)就可能引起食物中毒。該菌株還可產(chǎn)生3 種腸毒素和一種致吐毒素，致吐毒素的毒性比腸腹瀉毒素的毒性大，甚至可引起死亡。這種毒素是環(huán)肽物，含有12 個(gè)修飾的氨基酸，極耐熱，甚至可耐受121 ℃、1 h的加熱處理。年輕人和老年人群是主要的易感人群，在UHT乳中偶爾可見(jiàn)到由芽孢桿菌及其酶作用而產(chǎn)生的甜凝固。

在乳粉中，特別是嬰兒乳粉中不應(yīng)檢出蠟狀芽孢桿菌。但在生產(chǎn)實(shí)踐中，在乳的蒸發(fā)濃縮過(guò)程中會(huì)使芽孢發(fā)芽并有一定數(shù)量的繁殖，且在后期殺菌和噴霧干燥中不被殺死，使終產(chǎn)品中含有芽孢桿菌及其芽孢。

利用上述芽孢桿菌屬特性，一般檢測(cè)UHT設(shè)備的滅菌效率通常使用枯草芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢作為實(shí)驗(yàn)微生物（目標(biāo)菌），因?yàn)檫@些菌株，尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌，會(huì)形成相當(dāng)抗熱的芽孢，而肉毒棱狀芽孢桿菌用于罐內(nèi)滅菌的效率的測(cè)定。

5.2.2 梭狀芽孢桿菌

梭狀芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性，在無(wú)氧或微氧、營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下即可生長(zhǎng)。該菌的生長(zhǎng)溫度為3.3～80 ℃，最適溫度為25～40 ℃。多數(shù)菌為非致病性菌，但也有一些菌體具有強(qiáng)的致病性，許多梭菌可引起乳制品嚴(yán)重的質(zhì)量缺陷。

該菌廣泛分布于土壤、灰塵、水源、垃圾、動(dòng)物和植物體內(nèi)，即使健康的動(dòng)物體內(nèi)腸道也常常帶有一些芽孢。乳中常見(jiàn)的菌種有：生孢梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、拜氏梭菌、肉毒梭菌等。其中肉毒梭菌可產(chǎn)生耐熱性神經(jīng)毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生結(jié)腸炎腸毒素，而丁酸梭菌可產(chǎn)生致嬰兒壞死性結(jié)腸炎的腸毒素。梭狀芽孢桿菌在干酪產(chǎn)品成熟過(guò)程中可產(chǎn)生脫羧酶，使干酪中的游離氨基酸脫羧生成有毒性的生物胺，如組氨酸脫羧產(chǎn)生組胺，可致血管擴(kuò)張而出現(xiàn)低血壓，面頰潮紅，頭疼，小腸平滑肌收縮而導(dǎo)致嘔吐和腹瀉。

生乳中的污染菌數(shù)和種類較多，但梭菌對(duì)乳的污染較少，在乳中的芽孢數(shù)約為10～102CFU/mL。當(dāng)飼喂污染嚴(yán)重的青貯飼料時(shí)，乳中的芽孢數(shù)可達(dá)103CFU/mL以上，主要是產(chǎn)氣莢膜梭菌、丁酸梭菌、酪丁酸梭菌，約占總厭氧芽孢梭菌的75%以上。

乳制品中梭菌的來(lái)源主要是生乳，多見(jiàn)于冬季，在青貯飼料中檢出率高，特別是劣質(zhì)飼料。從各種干酪產(chǎn)品，如干酪醬及奶油、巴氏殺菌乳、乳粉、甜煉乳、酸奶、冰淇淋等產(chǎn)品中分離的菌數(shù)一般不超過(guò)10～100 CFU/mL。乳制品的質(zhì)地和風(fēng)味會(huì)受到梭菌生長(zhǎng)和代謝的影響，主要是干酪生產(chǎn)成熟過(guò)程中發(fā)生的所謂“后膨脹”現(xiàn)象；干酪內(nèi)形成大的網(wǎng)孔導(dǎo)致干酪斷裂、膨脹；產(chǎn)生的CO2、H2是形成氣孔和膨脹的原因。當(dāng)酪丁酸梭菌菌數(shù)為2×105CFU/mL時(shí)即可能導(dǎo)致干酪膨脹缺陷。該菌的生長(zhǎng)受干酪成熟時(shí)間、鹽、乳酸濃度和溫度的影響，另外，pH值，脂肪含量，其它菌的存在，干酪的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、氣眼也影響著菌的生長(zhǎng)。在變質(zhì)干酪中檢出的酪丁酸梭菌和生孢梭菌的芽孢數(shù)分別可達(dá)104～107CFU/g和103～106CFU/g。當(dāng)生乳中梭狀芽孢桿菌數(shù)超過(guò)1 CFU/mL時(shí)，則這種生乳不適宜于制作瑞士格魯耶爾干酪和艾曼塔爾牛乳硬干酪。

表1 我國(guó)學(xué)生飲用奶生乳的芽孢菌和嗜冷菌推薦性要求和可接受水平

5.2.3 棒狀桿菌

棒狀桿菌是一類非運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。與乳制品關(guān)系較大的菌是微桿菌屬。它在乳與乳制品中、乳品企業(yè)設(shè)備器具等處檢出率較高，為一種高度耐熱的微小桿菌，最適為溫度32 ℃。微桿菌有乳微桿菌和黃色微桿菌，前者可使淀粉分解，發(fā)酵麥芽糖，可耐72 ℃、30 min的加熱條件，屬高度耐熱菌。

5.3 嗜冷菌和耐熱菌的檢驗(yàn)

我國(guó)實(shí)施國(guó)家“學(xué)生飲用奶計(jì)劃”以來(lái)，積極推行“學(xué)生奶奶源升級(jí)計(jì)劃”，針對(duì)生產(chǎn)學(xué)生飲用奶所用生乳的芽孢菌和嗜冷菌指標(biāo)已明確提出了推薦性要求和可接受要求（表1）。

5.3.1 嗜冷菌菌落計(jì)數(shù)

測(cè)定嗜冷菌菌數(shù)有2 種常規(guī)的方法，同時(shí)也適用于計(jì)數(shù)假單胞菌。嗜冷菌的傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法是：在普通瓊脂平板上，7 ℃下培養(yǎng)7 天。另一方法為快速法，它與傳統(tǒng)方法相關(guān)性非常高，即在普通瓊脂平板上，21 ℃下培養(yǎng)25 h（因?yàn)槭壤渚淖钸m生長(zhǎng)溫度為20～22 ℃）。

用于假單胞菌計(jì)數(shù)的非選擇性培養(yǎng)基有許多種，如普通瓊脂平板、胰酶大豆瓊脂、氯化三苯基四唑瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂等均可用于分離計(jì)數(shù)。

為了提高測(cè)定熒光假單胞菌方法的特異性，使培養(yǎng)基可促進(jìn)菌體產(chǎn)生典型的綠色熒光物質(zhì)——綠膿菌熒光素，便于在紫外燈下觀測(cè)計(jì)數(shù)，設(shè)計(jì)了含有各種選擇性抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基，即選擇性平板培養(yǎng)基，如青霉素G、新霉素、放線菌素。

在培養(yǎng)計(jì)數(shù)假單胞菌時(shí)會(huì)受到許多其它革蘭氏陰性菌的干擾，為此，在心浸液的培養(yǎng)基中加入了選擇性抑制劑，如先鋒霉素、梭鏈孢酸鈉、溴化十六烷基三甲胺。該類培養(yǎng)基可有效地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和其它革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，提高假單細(xì)胞菌的檢出率。

5.3.2 耐熱菌的檢測(cè)方法

（1） 耐熱菌的檢測(cè)

首先取樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室巴氏殺菌處理，即62.8 ℃保持30 min，或80 ℃保持5 min；快速冷卻至室溫，然后按普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)的方法測(cè)定乳中的耐熱菌數(shù)。耐熱菌數(shù)應(yīng)低于100～200 CFU/mL，如果小于10 CFU/mL則說(shuō)明設(shè)備的衛(wèi)生質(zhì)量較好。

（2） 耐熱芽孢的檢測(cè)

同上方法取樣，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的高溫殺菌（100 ℃、10 min），快速冷卻至室溫，然后按普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)法傾注融化的瓊脂，并在凝固后將平板置于55 ℃下培養(yǎng)72 h，測(cè)定乳中的耐熱芽孢數(shù)。

（3） 梭菌的檢測(cè)方法

一些梭菌不能發(fā)酵乳糖，特別是丁酸梭菌和酪丁酸梭菌，不能生長(zhǎng)在乳中。但其可利用乳酸鹽和乙酸鹽，因此，可在干酪中生長(zhǎng)。

硫酸鹽還原酶是梭菌的共同特征，在培養(yǎng)基中加入小于0.05%的硫酸鈉、硫酸鐵，再加入半胱氨酸和巰基乙酸鹽，如有梭菌生長(zhǎng)則會(huì)在培養(yǎng)基中有黑色沉淀形成，含乳酸鹽培養(yǎng)基可產(chǎn)生氣體。

常用的選擇性培養(yǎng)基為硫酸鹽——多黏菌素——硫胺嘧啶（SPS瓊脂）。在厭氧條件，30～37 ℃下培養(yǎng)3 天，形成黑色菌落者即為梭菌，按平板稀釋法計(jì)數(shù)菌落數(shù)。也可采用分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)方法檢測(cè)梭菌。

5.4 嗜冷菌和耐熱菌的污染控制

嗜冷菌和耐熱菌對(duì)生乳的污染是不可完全避免的，污染后由于菌體在乳中的生長(zhǎng)繁殖及其在此過(guò)程中釋放的各種微生物酶，使乳中固有的成分發(fā)生了部分分解、被利用，同時(shí)產(chǎn)生菌體的代謝產(chǎn)物等，不僅降低了生乳的品質(zhì)和衛(wèi)生質(zhì)量，還會(huì)進(jìn)一步影響最終產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地、保質(zhì)期和衛(wèi)生安全性。因此，控制菌體的污染程度，降低相關(guān)微生物在乳中的活動(dòng)是減少微生物污染對(duì)乳制品質(zhì)量影響的有效途徑。

5.4.1 加強(qiáng)奶牛場(chǎng)和乳品企業(yè)的日常衛(wèi)生管理

奶牛場(chǎng)可以說(shuō)是乳制品加工的第一車間，在保證牛體健康的前提下，良好的擠乳工藝和設(shè)備衛(wèi)生是保證生乳質(zhì)量的主要條件。不論是嗜冷菌還是耐熱菌，其主要污染來(lái)源均是土壤、飼草、墊草、飲水、衛(wèi)生用水、牛體、牛舍的環(huán)境空氣等，青貯飼料中梭狀芽孢桿菌更多。改善牛舍的衛(wèi)生狀況，保證牛舍和牛體的清潔衛(wèi)生，就可大大降低生乳的污染程度。另外，嚴(yán)格執(zhí)行有效的對(duì)擠乳設(shè)備和儲(chǔ)乳罐、車的清洗消毒制度，會(huì)顯著降低擠乳后的二次污染，并有效抑制微生物在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸中的生長(zhǎng)和酶的作用。

5.4.2 謹(jǐn)慎實(shí)行預(yù)殺菌工藝

在國(guó)外，牛場(chǎng)或乳品企業(yè)有時(shí)對(duì)生乳進(jìn)行預(yù)巴氏殺菌（62～68 ℃，15 s）可有效降低生乳中的腐敗菌和酶活性，對(duì)乳成分和風(fēng)味沒(méi)有明顯的影響，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期，提高產(chǎn)品品質(zhì)。但必須是嚴(yán)格遵守執(zhí)行真正的預(yù)巴氏殺菌條件，即62～68℃，15 s。有的國(guó)家設(shè)有專門(mén)的法律來(lái)規(guī)定預(yù)巴氏殺菌工藝條件，以防止過(guò)度殺菌出現(xiàn)。

如采用菌數(shù)大于106CFU/mL的生乳生產(chǎn)UHT乳，比在UHT殺菌前在60℃下保持15 s的產(chǎn)品保質(zhì)期短。另外，在殺菌后繼續(xù)在60 ℃下保溫5 min，可使產(chǎn)品的保質(zhì)期延長(zhǎng)3～8倍，因?yàn)楸囟慰捎行У販缁畹鞍酌负椭久傅幕钚浴?/p>

預(yù)殺菌可顯著減少污染菌數(shù)。替代預(yù)殺菌的有效方法是將生乳儲(chǔ)藏在更低的溫度下（<2 ℃），但成本較高。

另外，對(duì)生乳實(shí)行預(yù)殺菌可增加干酪出品率（產(chǎn)品的得率）。這是因?yàn)樵擁?xiàng)低程度熱處理可降低β-酪蛋白和Ca從酪蛋白膠束中的解離，同時(shí)，降低微生物蛋白酶對(duì)乳蛋白的降解，從另一方面也增加了干酪出品率。

5.4.3 對(duì)生乳進(jìn)行有效的凈化除菌處理

在奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家，生乳一般采用離心除菌和微濾除菌，前者可除菌90%，而后者可除菌99%以上。

5.4.4 控制芽孢在乳中的生長(zhǎng)

在干酪生產(chǎn)中加入硝酸鹽、多聚硝酸鹽、乳鏈球菌素、納他霉素等可抑制芽孢菌的生長(zhǎng)繁殖。但這些添加物的使用，必須遵守國(guó)家食品添加劑有關(guān)使用管理規(guī)定。