摘 要 建立了貝類組織中2種腹瀉性貝毒（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）聚醚類毒素-大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）和鰭藻毒素（Dinophysistoxin-1，DTX-1）的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。貝類樣品經(jīng)80%甲醇溶液提取，經(jīng)正己烷脫脂和HLB固相萃取柱凈化，采用Pursuit C18（150 mm

SymboltB@ 3.0 mm，3

SymbolmA@ m，Varian公司）色譜柱分離，以80%（V／V）甲醇水溶液為流動(dòng)相等度洗脫，負(fù)離子掃描，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下進(jìn)行定性與定量分析。在4 ～200

SymbolmA@ g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，OA和DTX-1的最低定量限均為2

SymbolmA@ g/kg。添加水平在2， 25和50

SymbolmA@ g/kg時(shí)的平均回收率大于80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%（n＝6）。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；貝類毒素；大田軟海綿酸；鰭藻毒素；貝類產(chǎn)品

1 引 言

貝類毒素種類多、分布廣、毒性強(qiáng)。貝類毒素檢測(cè)直接關(guān)系到海產(chǎn)品的食用安全［1］。腹瀉性貝毒（Diarrhetic shellfish poisoning， DSP）是一種藻類毒素，因被人食用后主要產(chǎn)生以腹瀉為主要特征的中毒效應(yīng)而得名。DSP是一類脂溶性多環(huán)醚類天然化合物，主要來(lái)源于鰭藻屬（Dinophysis spp.）和原甲藻屬（Prorocentrum spp.）等有毒藻，通過(guò)食物鏈傳遞而大量存在于軟體貝類中。食用貝類導(dǎo)致腹瀉的癥狀最早于20世紀(jì)60年代出現(xiàn)在荷蘭。20世紀(jì)70年代， Yasumoto等[2]發(fā)現(xiàn)腹瀉性貝毒。根據(jù)毒素的結(jié)構(gòu)，DSP可以分成3類：聚醚類毒素-大田軟海綿酸（OA）和鰭藻毒素（DTX）;大環(huán)聚醚內(nèi)酯毒素-扇貝毒素（PTX）;融合聚醚毒素-蝦夷扇貝毒素（YTX）。此外，大田軟海綿酸的二元醇酯衍生物盡管沒(méi)有表現(xiàn)出和大田軟海綿酸同樣的毒性作用，但可以水解生成大田軟海綿酸，因此也應(yīng)視為此類毒素。OA和DTX-1是蛋白磷酸酶（PP1和PP2A）的有效抑制劑，因此可導(dǎo)致腹瀉、小腸上皮細(xì)胞的腹瀉型退化和促進(jìn)癌變的發(fā)展;同時(shí)可能影響到DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中的酶活性，從而帶來(lái)致畸效應(yīng)[3，4]。目前，已有多個(gè)國(guó)家或組織制定了貝類水產(chǎn)品中DSP限量標(biāo)準(zhǔn)，范圍為0～200

SymbolmA@ g/kg （OA）。

目前，常用的DSP分析方法主要分為生物檢測(cè)和化學(xué)檢測(cè)法及其它特殊檢測(cè)方法，主要包括小白鼠分析法[5～8]、氣相色譜法、液相色譜法[9，10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11，12]、酶活性抑制檢測(cè)技術(shù)[13]、酶聯(lián)免疫法[14，15]、細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)等[16，17]。生物檢測(cè)技術(shù)難于對(duì)毒素進(jìn)行分離檢測(cè)。而氣相色譜和液相色譜法技術(shù)需要繁瑣的衍生步驟，缺乏準(zhǔn)確的定性能力易造成假陽(yáng)性。隨著LC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，其在環(huán)境分析領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣。液相色譜優(yōu)越的分離能力與質(zhì)譜強(qiáng)大的定性定量功能相結(jié)合，可以克服其它方法定性不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。Draisci[11]和Vale[12]等利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)了貝類中的腹瀉性貝毒，液液萃取凈化，采用一級(jí)質(zhì)譜SIM模式（選擇離子監(jiān)測(cè)）進(jìn)行定性與定量分析。液液萃取技術(shù)試劑用量大，并且操作過(guò)程中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，采用一級(jí)質(zhì)譜SIM模式定性能力較弱容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。本研究利用固相萃取液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定貝類中兩種常見的腹瀉性貝毒OA和DTX-1，固相萃取能很好地去除雜質(zhì)的干擾，操作簡(jiǎn)便，OA的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 803.6/255.1和803.6/563.1， DTX-1的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 817.4/255.1和817.4/113.1。采用二級(jí)質(zhì)譜MRM模式（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）進(jìn)行定性分析，選擇兩對(duì)離子對(duì)定性更加準(zhǔn)確，利用其中豐度較高的離子對(duì)定量可以提高靈敏度。本方法應(yīng)用于實(shí)際樣品分析，靈敏度準(zhǔn)確度均能滿足日常檢測(cè)的要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200L液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（Varian公司）；KQ-300E超聲波儀（昆山儀器公司）；氮吹儀（安譜公司）；12位固相萃取裝置（Supelco公司）；Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL，Waters公司）；L-550離心機(jī)；Milli-Q純水儀（Millipore公司）。OA和DTX-1（北京伊普瑞斯科技公司），甲醇、丙酮、甲酸、正己烷（色譜純，TEDIA公司），其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

2.2 樣品處理

稱取2.0 g貝類樣品，加入4 mL 80%（V／V）甲醇溶液，超聲提取5 min，以4000 r/min離心10 min，重復(fù)提取一次，合并提取液，用5 mL正己烷脫脂兩次，棄去正己烷層，剩下溶液在45 ℃下氮?dú)獯抵良s2 mL用于固相萃取。HLB固相萃取小柱分別用3 mL甲醇、水活化，上樣后用 3 mL水和3 mL 10%（V／V）甲醇水溶液清洗，干燥后用5 mL甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈珊笥?mL初始流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22

SymbolmA@ m濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件： Pursuit C18液相色譜柱（150 mm

SymboltB@ 3.0mm，3

SymbolmA@ m， 美國(guó)Varian公司）；流動(dòng)相A為超純水，B為甲醇；80%（V／V）甲醇溶液等度洗脫6 min，流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積20

SymbolmA@ L；柱溫為30 ℃。

質(zhì)譜條件: 電離方式：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描（ESI－），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓－4200 V，保護(hù)電壓－600 V；離子源溫度50 ℃；霧化氣為空氣，壓力380 kPa，干燥氣為氮?dú)猓瑝毫楠?52 kPa， 干燥氣溫度300 ℃；碰撞氣為氬氣，壓力為0.29 kPa。碰撞能量均為45.5 V。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期母清林等： 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)貝類產(chǎn)品中腹瀉性貝類毒素

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用注射泵以10

SymbolmA@ L/min流動(dòng)注射的方式將1 mg/L OA和DTX-1標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源，分別在正負(fù)離子模式下工作，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物均適宜于負(fù)離子模式。利用一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析目標(biāo)化合物的分子離子峰，選取m/z 803.6和817.6為母離子，優(yōu)化電噴霧電壓、保護(hù)電壓、毛細(xì)管電壓等。利用二級(jí)質(zhì)譜全掃描收集各自的子離子信息，確定適合定性與定量分析的特征離子對(duì)。OA的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 803.6/255.1和803.6/563.1；DTX-1的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 817.4/255.1和817.4/113.1；優(yōu)化碰撞能量均為45.5 V。隨著碰撞氣壓力的升高，離子響應(yīng)信號(hào)也增強(qiáng)，碰撞氣壓力選擇0.29 kPa。

3.2 提取劑的選擇

生物體常用的提取劑有乙腈、甲醇、丙酮等，本實(shí)驗(yàn)比較了80%乙腈溶液和80%甲醇溶液的提取效率。結(jié)果表明，80%甲醇溶液提取效率優(yōu)于80%乙腈水溶液。在同一加標(biāo)水平，兩種提取劑提取后的溶液經(jīng)相同的固相萃取步驟后色譜圖如圖1所示?？赡苡捎趦煞N提取劑所提取的溶液基質(zhì)有一定差異，故兩次提取OA和DTX-1保留時(shí)間略有不同。

圖1 兩種提取溶提取同一加標(biāo)水平樣品總離子流圖（加標(biāo)10

SymbolmA@ g/kg）

Fig．1 TICs of two kinds extraction at the same spiked level （spiked level 10

SymbolmA@ g/kg）

對(duì)于貝類樣品，僅采用液液分配很難去除干擾物[11]，并且在液液萃取時(shí)容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，難于破乳，從而影響操作，故將粗提溶液采用正己烷脫脂后再用固相萃取小柱對(duì)提取液進(jìn)一步凈化。本實(shí)驗(yàn)采用HLB固相萃取小柱，萃取時(shí)先依次用3 mL甲醇、3 mL水預(yù)處理小柱，然后加入預(yù)先經(jīng)正己烷脫脂、氮吹后的樣品溶液，用3 mL純水淋洗鹽分，3 mL 10%甲醇溶液淋洗，然后干燥柱床，用5 mL甲醇洗脫；氮?dú)獯蹈珊笥? mL 80%甲醇溶液溶解殘?jiān)?，超聲溶解后過(guò)0.22

SymbolmA@ m濾膜供LC-MS/MS測(cè)定。

3.3 方法的線性范圍和檢出限

對(duì)于LC-MS分析，基質(zhì)效應(yīng)常常是影響準(zhǔn)確定量的干擾因素。為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析結(jié)果的影響，將DSP標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋后添加到2.0 g空白基質(zhì)中做標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制成樣品中含量為2， 5， 25， 50和100

SymbolmA@ g/kg的系列。用與樣品提取相同的步驟處理后進(jìn)行測(cè)定，以峰面積與加標(biāo)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，X軸代表峰面積，Y軸代表樣品濃度。在2～100

SymbolmA@ g/kg范圍內(nèi)，OA和DTX-1相關(guān)系數(shù)Ｒ2分別為0.9962， 09992。分別在空白基質(zhì)中添加標(biāo)樣，計(jì)算定量下限（LOQ，S/N＞10）， OA和DTX-1的LOQ均為2

SymbolmA@ g/kg。

3.4 回收率與精密度

以貽貝為研究對(duì)象，考察了方法的回收率和精密度（表1）。在空白樣中添加了3個(gè)水平的DSP標(biāo)準(zhǔn)，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定回收率和精密度，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，在DSP添加量為2， 25和100

SymbolmA@ g/kg時(shí)，OA的平均回收率分別為80.2%， 83.9%和90.2%，DTX-1的平均回收率分別為821%， 833%和1020%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11%。

表1 方法的加標(biāo)回收率和精密度

Table 1 Recoveries and RSDs of the method

化合物Compounds加入量

Added（

SymbolmA@ g/kg）回收率

Recovery（%）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

RSD（%，n＝6）

大田軟海綿酸 Okadaic acid （OA）2.0 25.0 100.080.2 83.9 90.210.6 9.5 9.2

鰭藻毒素 Dinophysistoxin-1 （DTX-1）2.0 25.0 100.082.1 83.3 102.010.1 9.9 7.1

3.5 樣品分析

利用本方法測(cè)定了市售85個(gè)貝類樣品，均未檢出DSP?？瞻讟悠芳翱瞻准訕?biāo)樣品（2

SymbolmA@ g/kg）色譜圖見圖2。對(duì)當(dāng)?shù)厥惺鄣奈母?、貽貝等進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出DSP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本方法操作簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，可以消除假陽(yáng)性，其回收率及重復(fù)性能滿足日常監(jiān)測(cè)的要求。

圖2 空白貽貝樣品（a）和加標(biāo)2

SymbolmA@ g/kg（b）的色譜圖

Fig．2 Chromatograms of blank mussel sample （a）， and mussel sample spiked with OA and DTX-1 of 2

SymbolmA@ g/kg （b）

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Determination of Diarrhetic Shellfish Poisoning in Shellfishes by

Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

MU Qing-Lin1，F(xiàn)ANG Jie1，WAN Han-Xing2，WANG Xiao-Hua1，CAO Liu-Yan1，ZHANG Qing-Hong1

1（Zhejiang Provincial Zhoushan Marine Ecological Environmental Monitoring Station，Zhoushan 31600）

2（College of Environmental Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266100）

Abstract A liquid chromatography-electrospray ionization triple-quadruple tandem mass spectrometric method has been established for the determination of two kinds of diarrhetic shellfish poisoning including okadaic acid （QA） and dinophysistoxin-1（DTX-1）. After being extracted using methanol and water（80∶20，V／V），the solution was extracted with n-hexane to remove lipid components and then cleaned-up by solid phase extraction （SPE） on an Oasis HLB cartridge. The analytes were eluted with methanol-water （80∶20，V／V） on a Pursuit C18 column （150 mm×3.0 mm， 3

SymbolmA@ m）. The quantitative and confirmatory determination of OA and DTX-1 was performed by multiple reactions monitoring （MRM） mode. OA and DTX-1 were determined in the negative ion mode. The calibration curve was linear in the range of 4－200

SymbolmA@ g/L. The quantification limits of OA and DTX-1 were 2

SymbolmA@ g/kg. The mean recoveries at spiked concentration of 2－100

SymbolmA@ g/kg were more than 80% and the relative standard deviations were less than 11% （n＝6）.

Keywords Liquid chromatography tandem mass spectrometry; Shellfish poisoning; Okadaic acid; Dinophysistoxin-1; Shellfish

（Received 13 June 2010; accepted 30 June 2010）