摘 要 建立了超高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-ESI-MS-MS）在負離子模式下測定人血中5種羥基多溴聯(lián)苯醚（HO-PBDEs）的方法。血清樣品中加入替代內(nèi)標13C12四溴雙酚-A（13C12TBBP-A），經(jīng)萃取、凈化、濃縮等預(yù)處理過程，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），掃描通道為：m/z 555→431，501→81，579→79；內(nèi)標法定量。方法回收率為（76.2±14）%～（97.8±5.7）%，檢出限（LOQ）為1.0～2.0ng/g#8226;脂肪。應(yīng)用本方法對人血樣品進行測定，檢出5-HO-BDE-47，6-HO-BDE-47，5′-HO-BDE-99，6′-HO-BDE-99；∑HO-PBDEs濃度范圍為未檢出至19 ng/g（脂肪中），其中6-HO-BDE-47含量最高，占HO-PBDEs總量的48.7%～100%。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜; 人血; 羥基多溴聯(lián)苯醚

1 引 言

多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）是應(yīng)用廣泛的溴代阻燃劑（BFRs）之一，主要添加在紡織、裝修材料、電子、電器等產(chǎn)品中。由于PBDEs具有持久性、生物蓄積、長距離遷移及毒性等特點[1]，被認為是全球普遍存在的環(huán)境污染物。PBDEs在各種環(huán)境介質(zhì)（大氣、土壤、底泥、室內(nèi)空氣）、生物體（魚、鳥、哺乳動物）以及人體血液、母乳、組織、膽汁中均有檢出[2～4]。生物體中的羥基多溴聯(lián)苯醚（HO-PBDEs）被認為是PBDEs的代謝產(chǎn)物[5，6]。研究表明，PBDEs某些羥基代謝產(chǎn)物 HO-PBDEs具有跟PBDEs相同或更大的生物毒性[7，8]。在人體中已檢出4-HO-BDE-42，3-HO-BDE-47，5-HO-BDE-47，6-HO-BDE-47，5′-HO-BDE-99，6′-HO-BDE-99以及溴苯酚等多種PBDEs羥基化代謝產(chǎn)物[9，10]。

目前，用于分析環(huán)境樣品和生物樣品中羥基化PBDEs的方法有氣相色譜-電子捕獲負離子-質(zhì)譜（GC-ECNI-MS）[8，11]、氣相色譜-電子轟擊-質(zhì)譜（GC-EI-MS）[12]、氣相色譜/高分辨電子轟擊-質(zhì)譜（GC-HREI-MS）[13]，液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜-質(zhì)譜（LC-APCI-MS-MS）[14]，液相色譜-離子噴霧-質(zhì)譜-質(zhì)譜（LC-ISP-MS-MS）[15]等。用GC-MS對HO-PBDEs進行檢測，靈敏性高，但分析時間長，需要對樣品進行衍生化處理，衍生化反應(yīng)不充分，且反應(yīng)中需要重氮甲烷、硫酸二甲酯，硫酸二乙酸等有毒物質(zhì)[9，10，16]。相比之下，LC-MS技術(shù)檢測速度快，樣品無需衍生化。本研究建立了超高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（LC-ESI-MS-MS）測定人血中幾種HO-PBDEs的分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-ESI-MS-MS）（美國Waters），色譜柱（C18反相柱，50 mm×2.1 mm，1.7 SymbolmA@ m）（美國Waters）， Avanti.J-25高速離心機（美國Beckman），BF2000氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司）。

正己烷、二氯甲烷、甲醇（農(nóng)殘級，美國J.T.Baker公司），甲基叔丁基醚（HPLC級，美國DIMA公司），異丙醇（（HPLC級，美國Fisher公司），超純水經(jīng)美國Millipore公司超純水系統(tǒng)處理；硅膠（德國MERCK公司），其它試劑均為分析純（北京北化精細化學(xué)品有限責任公司）。高純氮氣、高純氬氣、液氮（北京誠為信氣體公司）。

13C12四溴雙酚-A（13C12TBBP-A，純度大于99%，Cambridge Isotope Laboratories Inc.）；12C123-羥基-2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚（12C123-HO-BDE-47），12C125-羥基-2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚 （12C125-HO-BDE-47），12C126-羥基-2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚（12C126-HO-BDE-47），12C125′-羥基-2，2′，4，4′，5-五溴聯(lián)苯醚（12C125′-HO-BDE-99），12C126′-羥基-2，2′，4，4′，5-五溴聯(lián)苯醚（12C126′-HO-BDE-99）標準品（純度均在97%以上，美國AccuStandard）。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準溶液的配制 以13C12TBBP-A為替代內(nèi)標，配制一系列不同濃度的3-HO-BDE-47，5-HO-BDE-47，6-HO-BDE-47， 5′-HO-BDE-99和6′-HO-BDE-99混合標準樣品，定容備用。

2.2.2 血清樣品采集與預(yù)處理血清樣品于2009年4月在我國某PBDEs生產(chǎn)源區(qū)醫(yī)院采集，抽取志愿者靜脈血約10 mL，離心得到約3 mL血清（供血者為當?shù)亟】的行裕挲g在25至35歲之間）。樣品采集后置于車載冰箱，帶回實驗室后置于－18 ℃冰箱保存直到分析。分 析 化 學(xué)第39卷

第1期王 英等：超高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析人血中羥基多溴聯(lián)苯醚

在血清樣品中加入4 ng替代內(nèi)標 13C12TBBP-A，再加入1 mL 6 mol/L HCl，振蕩混勻，再加入6 mL異丙醇，然后用6 mL正己烷/甲基叔丁基醚（1∶1， V／V）萃取。完全混勻后，離心5 min（3000 r/min），將有機相轉(zhuǎn)入到裝有4 mL KCl水溶液（1%，m/m）的玻璃試管中。血清樣品再用3 mL正己烷/甲基叔丁基醚（1∶1， V／V）萃取3次，轉(zhuǎn)入到上述裝有4 mL KCl水溶液（1%，m/m）的玻璃試管中。再次離心，將有機相轉(zhuǎn)入已恒重試管中。水溶液用4 mL正己烷/甲基叔丁基醚（1∶1， V／V）再萃取3次，萃取液并入恒重試管。將溶劑吹干，利用重量分析法測定血清中脂肪的含量（0.039～0.071 g）。

在恒重的試管中加入4 mL正己烷、2 mL 0.5 mol/L KOH，溶于乙醇-水， 1∶1，V／V），振蕩混勻，3000 r/min離心5 min， 將有機相移走。水相部分加入0.5 mL 2 mol/L HCl，振蕩混勻，然后加入4 mL正己烷/甲基叔丁基醚（9∶1， V／V）萃取，取上層有機相至離心管，下層再萃3次。將萃取液氮吹至1 mL，然后過1 cm高的酸性硅膠柱，硅膠柱用3 mL正己烷活化，12 mL二氯甲烷洗脫。最后，洗脫液用高純氮吹干，加入替換溶劑乙酸乙酯，定容備用。

2.2.3 色譜-質(zhì)譜條件 流動相：甲醇-水（4∶3，V／V），流速0.25 mL/min，進樣量3 SymbolmA@ L。柱溫，35 ℃；樣品溫度，10 ℃。電噴霧負離子掃描模式（ESI－），多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。監(jiān)測離子通道：13C12TBBP-A，m/z 555→431；HO-BDE-47，m/z 501→81；HO-BDE-99，m/z 579→79。毛細管電壓3 kV，錐孔電壓45 V，碰撞氣電壓40 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流速2.2 L/min，脫溶劑氣流速9.2 L/min， 碰撞氣流速0.25 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 定性與定量分析

13C12TBBP-A，5-HO-BDE-47以及5′-HO-BDE-99標準品在電噴霧負離子模式（ESI－）下全掃描（MS Scan）得到的一級質(zhì)譜圖，如圖1所示。對 13C12TBBP-A和5種HO-PBDEs標準品做子離子掃描，其子離子掃描質(zhì)譜圖如圖2所示。13C12TBBP-A的特征碎片離子峰中，m／z 431的豐度最高，其次為m／z 79，再次為m／z 460。其碎裂途徑為：[M－H]－→[M－Br－OH]－→[M－Br－OH－CO]－→[Br]－。選擇m／z 431為13C12TBBP-A 的特征碎片離子峰。3-HO-BDE47，5-HO-BDE47子離子中[Br]－的m／z 81最高，其次為m／z 251。其碎裂途徑為： [M－H]－→[M-C6H3Br2O]－→[Br]－；6-HO-BDE-47的子離子中m／z 79的相對豐度最高。5′-HO-BDE-99的子離子中m／z 79的相對豐度最高；6′-HO-BDE-99子離子中[Br]－的m／z 79的相對豐度最高，其次為m／z 329。其碎裂途徑為：[M－H]－→[M-C6H3Br2O]－→[Br] －。[Br]－相對于其它碎片離子更加穩(wěn)定且特征明顯，因此選擇[Br]－ 為HO-PBDEs的子離子與母離子組成定量離子對。本研究在ESI－模式下，使用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜在多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）下測定血清樣品選擇的通道為：13C12TBBP-A，[M－H]－→[M－Br－OH－CO]－；HO-PBDEs，[M－H]－→[Br]－通道。

使用Masslynx4.1軟件，依據(jù)3-HO-BDE-47，5-HO-BDE-47，6-HO-BDE-47與5′-HO-BDE-99，6′-HO-BDE-99信號峰面積與13C12TBBP-A同位素標樣峰面積比進行定量分析。

圖1 13C12TBBP-A （a）， 5-HO-BDE-47 （b）和5′-HO-BDE-99（c）的全掃描質(zhì)譜圖（[M－H]－）

Fig．1 Mass spectra （[M－H]－） of 13C12 tetrabromobisphenil-A（TBBP-A）（a）， 5-hyoloxylated 2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether（5-HO-BDE-47） （b） and 5′-hyoloxylated 2，2′，4，4′-pentabromodiphenyl ether（ 5′-HO-BDE-99）（c）

3.2 標準曲線與檢出限

按上述色譜-質(zhì)譜條件測定配制的系列標準溶液，以3-HO-BDE-47，5-HO-BDE-47，6-HO-BDE47，5′-HO-BDE99，6′-HO-BDE99與13C12TBBP-A的濃度比與峰面積比做定量校準曲線。5種羥基多溴聯(lián)苯醚的回歸方程、線性區(qū)間和檢出限見表1。

表1 5種羥基多溴聯(lián)苯醚的回歸方程、線性區(qū)間和檢出限

Table 1 Regression equations， Linear range and limits of determination limits of 5 HO-PBDEs

羥基多溴聯(lián)苯醚HO-PBDEs線性范圍

Linear equation線性相關(guān)系數(shù)

Correlation coefficient

（R2）方法檢出限

Limit of detaction

（LOQ）* （ng/g）

3-HO-BDE-47

1～800

y＝0.0728x＋0.0300

0.9999

1.0

5-HO-BDE-47

1～800

y＝0.0550x＋0.0047

1.0000

1.0

6-HO-BDE-47

1～800

y＝0.0864x＋0.0300

1.0000

1.0

5′-HO-BDE-99

1～800

y＝0.0886x＋0.0132

1.0000

1.0

6′-HO-BDE-99

1～800

y＝0.1237x＋0.0199

1.0000

2.0 * Note： 檢出限指每克脂肪中的HO-PBDEs量（LOQ is the HO-PBDEs in one gram of lipid）。

3.3 回收率與精密度

做3個空白加標平行樣驗證方法回收率（5種羥基多溴聯(lián)苯醚的加入量均為8 ng），以血清樣品中加入4 ng 13C12TBBP-A測13C12TBBP-A的回收率為樣品回收率。內(nèi)標和5種羥基多溴聯(lián)苯醚的回收率分別為： 13C12TBBP-A（76.2±14）%，3-HO-BDE-47（79.3±6.2）%，5-HO-BDE-47（83.1±5.4）%，6-HO-BDE-47（88.2±5.9）%，5′-HO-BDE99（92.7±6.4）%和6′-HO-BDE99（97.8±5.7）%。

3.4 人血中HO-PBDEs的濃度測定

利用上述方法對6個人血樣品進行測定，在5個樣品中檢出HO-PBDEs（見表2）。檢出HO-PBDEs：5-HO-BDE-47，6-HO-BDE-47，5′-HO-BDE-99，6′-HO-BDE-99。其中，5-HO-BDE-47，5′-HO-BDE-99分別在兩個樣品中有檢出，6′-HO-BDE-99在一個樣品中檢出；6-HO-BDE-47在5個樣品中均有檢出，濃度為3.7～9.2 ng/g#8226;脂肪，分別占單個樣品HO-PBDEs總檢出量的48.7%～100.0%。Qiu等[9]研究也表明人體中5-HO-BDE-47和6-HO-BDE-47是BDE-47主要的代謝產(chǎn)物。幾個血樣中均未檢出3-HO-BDE-47，但在579→79通道下，5.25 min時在提取離子流圖中出現(xiàn)一個未知峰，見圖3b，這可能是BDE-99其它羥基化的產(chǎn)物，但由于沒有相應(yīng)的標樣，無法準確定性。

Fig．3 Total ion chromatogram of standard mixture （a） and human serum sample （b） for internal standard and five hyyolroxylated polybrominated diphenyl ethers（HO-PBDEs）

1． 13C12TBBP-A；2． 3-HO-BDE47；3． 5-HO-BDE47；4． 6-HO-BDE47；5． 5′-HO-BDE99；6． 6′-HO-BDE99.

本研究結(jié)果表明，利用超高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析人血中HO-PBDEs，具有顯著優(yōu)點：（1）相對于用用氣相色譜-質(zhì)譜對HO-PBDEs進行檢測，縮短了檢測時間，并且無須對樣品衍生化，簡化了預(yù)處理過程；（2）超高效液相色譜的使用縮短了HO-PBDEs同分異構(gòu)體分離時間并保障了好的分離效果，樣品用量少，更適合人體中痕量污染物的檢測；（3）通過掃描[M－H]－→[Br]－通道檢測目標物，即多重反應(yīng)監(jiān)測，能最大限度排除人血樣品中可能存在的干擾物質(zhì)，更準確地進行定性和定量分析。

References

1 Darnerud P O，Eriksen G S， Jóhannesson T， Larsen P B， Viluksela M. Environ. Health Perspect，2001， 109（Suppl 1）： 49～68

2 Hites R A. Environ. Sci. Technol.，2004， 38（4）： 945～956

3 QU Wei-Yue， BI Xin-Hui， SHENG Guo-Ying， LU Shao-You， FU Jia-Mo（屈偉月， 畢新慧， 盛國英， 陸少游， 傅家謨）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)），2007， 35（7）: 1015～1017

4 Covaci A，Voorspoels S，de Boer J. Environ. Int.，2003， 29（6）： 735～756

5 Qiu X，Mercado-Feliciano M，Bigsby R M，Hites R A. Environ. Health Perspect，2007， 115（7）： 1052～1058

6 Marsh G，Athanasiadou M，Athanassiadis I，Sandholm A. Chemosphere，2006， 63（4）： 690～697

7 Cantón R F， Scholten D E A， Marsh G， de Jong P C， van den Berg M. Toxicol Appl. Pharm.，2008， 227（1）： 68～75

8 Hamers T， Kamstra J H， Sonneveld E， Murk A J， Visser T J， van Velzen M J M. Mol. Nutr. Food Res.，2007， 52（2）： 284～298

9 Qiu X， Bigsby R M， Hites RA. Environ Health Perspect，2009， 17（1）： 94～98

10 Lacorte S，Ikonomou M G. Chemosphere，2009， 74（3）： 412～420

11 Marsh G， Athanasiadou M， Bergman A， Asplund L. Environ. Sci. Technol.，2004， 38（1）： 10～18

12 JIANG Jin-Hua， CHEN Tao（江錦花， 陳 濤）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)），2009， 37（11）: 1627～1632

13 Valters K， Li H， Alaee M， D′Sa I， Marsh G， Bergman ， Letcher R J. Environ. Sci. Technol.，2005， 39（5）： 5612～5619

14 Kato Y，Okada S，Atobe K，Endo T，Matsubara F，Oguma T，Haraguchi K. Anal. Chem.，2009， 81（14）： 5942～5948

15 Mas S， Jáuregui O， Rubio F， de Juan A Tauler R， Lacorte S. J. Mass Spectrom/，2007， 42（7）： 890～899

16 Athanasiadou M，Cuadra SN，Marsh G，Bergman A，Jakobsson K. Environ. Health Perspect，2008， 116（3）： 400～408

Determination of Hydroxylated Polylrominated Diphenyl

Ethers in Human Serum by Ultra Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Ying， DING Wen-Wei， JIN Jun*

（Minzu University of China， College of Life and Environmental Science， Beijing 100081）

Abstract A new method has been developed for the simultaneous analysis of five hydroxylated polybrominated diphenyl ethers（HO-PBDEs） in human serum using ultra performance liquid chromatography-electrospray ion source tandem mass spectrometry （UPLC-ESI-MS-MS） in negative ion mode. The serum samples were spiked with 13C12Tetrabromobisphenol-A（TBBP-A） as surrogate internal standard before extracting， then the samples were further cleaned up and concentrated. Detection was performed by multiple reaction monitoring （MRM） mode in three channels， 555→431， 501→81 and 579→79. The recovery of spiked 13C12TBBP-A and five HO-PBDE congeners in blank samples was from （76.2±14）% to （97.8±5.7）%， the limit of qualification （LOQ） were between 1.0 and 2.0 ng/g#8226;lipid. 5-HO-2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether （5-HO-BDE-47）， 6-HO-2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether （6-HO-BDE-47）， 5′-HO-2，2′，4，4′，5-pentabromodiphenyl ether （5′-HO-BDE-99）， 6′-HO-2，2′，4，4′，5-pentabromodiphenyl ether （6′-HO-BDE-99） had been detected and the concentration of ∑HO-PBDEs ranged from no detection to 18.9 ng/g#8226;lipid in six serum samples from volunteers living around PBDEs manufactory. 6-HO-BDE-47 was the most abundant HO-PBDEs congener accounting for 48.7% to 100．0% of total HO-PBDEs in each sample. The proposed method based on UPLC-MS-MS has been applied to directly determine HO-PBDEs in human serum without derivatization．

Keywords Ultra performance liquid chromatography-electrospray ion source tandem mass spectrometry; Human serum; Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers

（Received 8 April 2010; accepted 23 July 2010）