摘 要 采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)對染砷后Chang肝細胞中的砷代謝產(chǎn)物進行分析。通過參考文獻及相關(guān)實驗推測出兩種未知砷代謝產(chǎn)物，并采用標(biāo)準合成加入法證明其中一種未知砷代謝產(chǎn)物為一甲基亞胂酸（MMAⅢ）。定量分析結(jié)果顯示，隨著染砷濃度的增大，細胞中的一甲基砷、二甲基砷以及無機砷含量均呈現(xiàn)增大趨勢，而甲基化率卻呈現(xiàn)減小趨勢，這說明高濃度砷對細胞甲基化能力有抑制作用。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜；電感耦合等離子體質(zhì)譜；飛行時間質(zhì)譜；Chang肝細胞；砷形態(tài)；一甲基亞胂酸

1 引 言

砷是人體中最豐富的12種元素之一，同時砷也是確認的致癌毒物[1，2]。長期接觸砷會對人體多種組織、器官造成危害，嚴重損害人類健康和勞動能力[3]。隨著人們對健康程度的重視，砷在人體內(nèi)代謝過程的研究也備受關(guān)注。無機砷進入機體后，主要在肝臟中發(fā)生生物甲基化，產(chǎn)生一系列甲基化砷代謝產(chǎn)物[4～6]，而這些產(chǎn)物的種類和毒性決定了砷的各種生物效應(yīng)，因而準確分析和表征砷代謝產(chǎn)物是砷生物代謝研究的基礎(chǔ)。然而，由于砷代謝產(chǎn)物的含量極低且種類眾多，而與之相應(yīng)的商業(yè)化的砷形態(tài)標(biāo)準物質(zhì)種類較少，這為砷代謝產(chǎn)物的表征帶來了很大的難度。

此前，本研究組建立了人肝細胞中的砷總量及砷代謝產(chǎn)物形態(tài)分析的方法，并對染砷后Chang肝細胞中的總砷含量進行了分析，初步考察了染砷后Chang肝細胞中的砷代謝產(chǎn)物[7]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）技術(shù)考察在不同染砷濃度下的Chang肝細胞中砷代謝產(chǎn)物的種類和含量。對于無法用商業(yè)化標(biāo)準表征的砷代謝產(chǎn)物，本研究采用人工合成標(biāo)準加標(biāo)的方法，依據(jù)保留時間一致性對未知的砷代謝產(chǎn)物進行定性分析[8～10]。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，美國Agilent公司），配Babington高鹽霧化器，雙通路霧化室；1100型高效液相色譜 （HPLC，美國Agilent公司），配二元泵及手動進樣器；Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱（250 mm×4.1 mm i.d.， 瑞士Hamilton Reno公司）；Shodex Asahipak GS-220 HQ 凝膠過濾色譜柱（300 mm×7.6 mm i.d.， 日本Showa Denko公司）；G1969A 飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS，美國Agilent公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）；AL104 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

（NH4）2CO3， NH4NO3，Na2SO3，KI，HCl，Na2S，ＣH3ＯH（優(yōu)級純，德國Sigma-Aldrich公司），AsI3和As2O5（美國Alfa Aesar公司）；二甲基胂酸（DMA，美國Acros Organics公司）；一甲基胂酸（MMA，清華大學(xué)惠贈），所有形態(tài)分析標(biāo)準溶液均在4 ℃條件下避光保存。實驗用水均由超聲脫氣后的18.2 MΩ cm超純水（由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得）配制。

2.2 細胞染砷及收集

染砷細胞樣品是與沈陽中國醫(yī)科大學(xué)合作培養(yǎng)獲得。以NaAsO2溶液進行染砷，染砷濃度為1.0，50， 10和20 SymbolmA@ mol/L，培養(yǎng)及收集方法參見文獻[7]。

2.3 一甲基亞胂酸（MMAⅢ）的制備

一甲基亞胂酸的制備參照文獻[11]的方法，通過SO2還原一甲基胂酸制備而成。其合成步驟如下：在具有雙孔膠塞的錐形瓶內(nèi)加入含有100 mg/L一甲基胂酸（MMAⅤ）， 0.5 mol/L H2SO4及 0.3 g KI的混合液，適當(dāng)加熱后向該混合液中通入過量的由Na2SO3與HCl反應(yīng)生成的SO2氣體，該過程持續(xù)20 min，至溶液充分飽和，隨后迅速冷卻至4 ℃。此時在錐形瓶底部可以見到黃色針狀的固體（一甲基胂酸的二碘化物（MMAI2）），過濾后將該固體溶解于脫氣后的超純水中，此時MMAI2在水中水解為MMAⅢ。在MMAⅢ的溶液中加入適量Na2CO3， 平衡陰陽離子，隨后將MMAⅢ萃取至苯中，N2吹干苯后即可得到有刺激性氣味的白色固體，即為一甲基亞胂酸的氧化物。將該固體再次溶于脫氣后的超純水中配制成高濃度的MMAⅢ儲備液，而后用離子色譜按照色譜方法A（表1）連續(xù)7次分離純化該標(biāo)準，收集純化后的組分，于4 ℃避光保存，此標(biāo)準可保存48 h。

2.4 HPLC-ICP-MS及HPLC-TOF-MS分析染砷肝細胞中砷化學(xué)形態(tài)

樣品處理：為保證砷在樣品中所存在形態(tài)不發(fā)生變化，細胞樣品從－70 ℃超低溫冰箱取出后吹入高純N2，置于4 ℃解凍，再經(jīng)超聲混勻，過0.45 SymbolmA@ m醋酸纖維膜后直接進樣測定。

HPLC-ICP-MS工作條件：采用高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體（ICP-MS） 聯(lián)用技術(shù)對細胞樣品中的砷形態(tài)及合成的砷標(biāo)準進行表征。色譜條件及儀器操作參數(shù)見表1。由于35Cl和儀器所用的高純載氣（Ar）易形成75ClAr＋，干擾75As，因此，在砷的形態(tài)分析中，采用了時間分辨分析模式，儀器同時監(jiān)測75As， 72Ge， 35Cl， 77Se， 83Kr的信號，用以排除75ClAr＋干擾峰[3]。此外考慮到生物樣品中往往含有大量的硫化物及磷化物，故在測定過程中34S和31P的信號也同時采集。

流動相 A Mobile phase AH2O50 mmol/L ammonium acetate （pH 6.5 at 25 ℃）

流動相 B Mobile phase B50 mmol/L （NH4）2CO3（pH＝7.4 adjusted by acetic acid） and 2% （Ｖ/Ｖ） MeOH

洗脫梯度 Gradient programTime（min）A（%）B（%）

01000

150100

301000

ICP-MS儀器參數(shù) Instrumental Parameters of ICP-MS

功率RF power1350 W蠕動泵轉(zhuǎn)速Peristaltic pump flow rate30 r/min

RF matching1.6 V檢測同位素Monitored signals75As， 72Ge， 35Cl， 77Se， 83Kr， 34S載氣流Carrier gas flow rate1.10 L/min

ESI-TOF-MS工作條件：采用電噴霧高分辨飛行時間質(zhì)譜（ESI-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)對合成的砷化物標(biāo)準進行表征，進入高分辨飛行時間質(zhì)譜的流動相流速分流至0.4 mL/min。電噴霧質(zhì)譜為負離子模式，掃描范圍m/z 75～500；毛細管電壓：4000 V；噴霧氣壓：3.447 kPa；干燥氣流速（N2）：11.0 L/min；氣體溫度：330 ℃；裂解電壓：100 V；參比溶液：m/z 121.0509，922.0098；分辨率：9500±500（922.0098）。

3 結(jié)果與討論

3.1 Chang肝細胞中砷形態(tài)分析

SymbolmA@ mol/L染砷濃度的染砷細胞液進行分析，結(jié)果見圖1a。當(dāng)采用HPLC-ICP-MS分析1.0 SymbolmA@ mol/L染砷濃度的染砷細胞液時，發(fā)現(xiàn)細胞液中存在6種不同砷化物，通過與商業(yè)化砷形態(tài)標(biāo)準物質(zhì)的保留時間對比發(fā)現(xiàn)，其中的4種砷化物可以被表征: As（tr＝3.135 min）， DMAⅤ（tr＝4.73 min），MMAⅤ（tr＝9.257 min） 和As（tr＝11.20 min）。盡管As是培養(yǎng)底物，但實驗結(jié)果顯示As的含量遠遠高于As，這可能是由于細胞培養(yǎng)過程在5%CO2/95%空氣的條件下進行，在此期間，大部分As被氧化為As，被細胞攝入，從而致使細胞內(nèi)大部分的砷以As的形態(tài)存在。此外，MMAⅤ和DMAⅤ的出現(xiàn)證明細胞對外源無機砷進行了生物甲基化代謝。根據(jù)砷代謝模式[12，13]，DMAⅤ的存在證明了在人肝細胞中至少發(fā)生了兩次砷甲基化的代謝反應(yīng)，這與文獻[11]的研究結(jié)果吻合。

除了以上4種可表征的砷代謝產(chǎn)物外，Chang肝細胞中還存在兩種未知代謝產(chǎn)物（UN1和UN2，對應(yīng)保留時間分別為3.895 和14.00 min）無法用已有的商業(yè)化的砷標(biāo)準物質(zhì)進行表征。采用HPLC-ESI-TOF-MS對這兩種未知代謝產(chǎn)物進行分析，但由于細胞中砷代謝產(chǎn)物的含量過低，TOF-MS無法在線給出這兩種砷化物的分子量數(shù)據(jù)。Li等[14]報道，在Chang肝細胞代謝外源無機砷時會產(chǎn)生一甲基亞胂酸（Methylarsonous acid， MMAⅢ），它是外源無機砷在第一次甲基化代謝和第二次甲基化代謝之間的中間代謝產(chǎn)物。這說明兩種未知砷化物中至少有一種是甲基亞砷酸類物質(zhì)；其次，樣品分析過程中對細胞液中的34S進行了實時同步的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在未知砷化物UN2出峰位置同時監(jiān)測到了75As和34S的信號，這說明UN2砷化物中至少有一個含硫官能團，從而間接證明UN1是MMAⅢ；此外，H2O2可以使砷化物脫掉巰基而不影響砷化物上其它官能團[15]。本實驗中，當(dāng)在細胞樣品中加入適量H2O2反應(yīng)4 h后， 圖1 1.0 SymbolmA@ mol/L染砷濃度下Chang肝細胞中砷形態(tài)HPLC-ICP-MS譜圖

Fig．1 HPLC-ICP-MS chromatograms of Chang liver cells at 1.0 SymbolmA@ mol/L incubation concentration

a. H2O2處理前（Directly injected hepatocytes solution）; b. H2O2處理后（Hepatocytes solution treated by hydrogen peroxide）; UN: Presents an unknown arsenic peak; As: Arsenite; As: Arsenate; MMAⅤ. Monomethylarsenous acid; DMAⅤ： Dimethylarsinic acid\\.細胞樣品中的砷形態(tài)大大簡化（圖1b）。由于H2O2的氧化作用，As全部轉(zhuǎn)變?yōu)锳s。此外，圖1a中顯示的兩個未知峰全部消失，與此對應(yīng)的是一甲基胂酸（MMAⅤ）的含量成比例增加，這說明兩種未知砷化物均為MMAⅤ的類似物。

基于以上的信息，推測未知砷化物UN1為（MMAⅢ），UN2推測為一種含S的一甲基砷化物?；谀壳靶畔⑸袩o法準確推斷UN2的種類和結(jié)構(gòu)，故本研究僅對UN1進行定性表征。

3.2 一甲基亞胂酸（MMAⅢ）的表征

利用ESI-TOF-MS對合成出MMAⅢ進行表征，經(jīng)過色譜柱純化的MMAⅢ溶于50 mmol/L （NH4）2CO3和5%甲醇混合液中，以乙酸調(diào)至pH 7.4，以0.4 mL/min的流速直接泵入ESI-TOF-MS中檢測。圖2a顯示了MMAⅢ的ESI-TOF-MS表征結(jié)果，在合成的MMAⅢ樣品中，產(chǎn)生了一個m/z 122.9420 [M]－的分子離子峰， 該分子量與理論計算得到的MMAⅢ的理論減氫峰分子量（m/z 122.9427 [M]－）的質(zhì)量偏差Δm為－5.7 ppm。滿足定性分析要求。

3.3 加標(biāo)法分析Chang肝細胞中的MMAⅢ

由于Chang肝細胞中未知峰的含量非常低，無法用有機質(zhì)譜直接測定其準確分子量，因此，本研究采用加標(biāo)法對未知砷化物進行表征。將合成后的MMAⅢ加入細胞樣品中，采用HPLC-ICP-MS測定細胞中加標(biāo)后的砷形態(tài)，通過保留時間的一致性對未知化合物進行表征。結(jié)果見圖2。

圖2b顯示了采用色譜條件A，即陰離子色譜與ICP-MS聯(lián)用測定加標(biāo)前后細胞樣品中砷形態(tài)的譜圖。對比這兩個譜圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入MMAⅢ后，未知峰UN1的峰面積顯著增大。通過連續(xù)測定樣品考察其保留時間發(fā)現(xiàn)，未知峰UN1的保留時間與合成的MMAⅢ標(biāo)準的保留時間的RSD僅為2.2%（n＝5）。

考慮到加標(biāo)法表征未知化合物時，本方法無法區(qū)分一些性質(zhì)相近的物質(zhì)，尤其是在色譜柱上保留時間一致或相近的物質(zhì)。為了排除這種影響，本研究采用小分子凝膠色譜建立了第二種色譜分離法（色譜條件B，表1）對樣品進行重復(fù)分析，結(jié)果見圖2c。研究顯示，當(dāng)采用凝膠色譜分析加標(biāo)前后細胞樣品時得到了與離子色譜相似的結(jié)果。加標(biāo)后，（2）號譜圖中的未知峰UN1的峰面積顯著增大，UN1的保留時間與MMAⅢ的保留時間的RSD為3.5%（n＝5）。因而可以確認，未知砷化物UN1為一甲基亞胂酸（MMAⅢ）。

圖2 5.0 SymbolmA@ mol/L染砷組細胞中MMAⅢ 的ESI-TOF-MS表征質(zhì)譜圖及HPLC-ICP-MS加標(biāo)譜圖

Fig．2 Chromatograms for identification of methylarsonous acid（MMAⅢ） standard and fortification of MMAⅢ and in 5 SymbolmA@ mol/L incubation concentration hepatocytes solution using chromatogram A and B

a． MMAⅢ的ESI-TOF-MS表征質(zhì)譜（Identification of MMAⅢ standard using ESI-TOF-MS）；b. 采用色譜條件A的HPLC-ICP-MS加標(biāo)譜圖 （Chromatography A， （1） arsenic species in hepatocytes sample; （2） fortification of MMAⅢ and MMTA in hepatocytes sample using chromatogram A）; c. 采用色譜條件B的加標(biāo)譜圖（Chromatogram B）， （1） 加標(biāo)前（Arsenic species in hepatocytes sample）; （2） 加標(biāo)后（Ｆortification of MMAⅢ and MMTA in hepatocytes sample using chromatogram B）。

3.4 不同染砷濃度下Chang肝細胞中砷形態(tài)分析

本研究對不同染砷濃度條件下肝細胞中的砷形態(tài)進行了分析，結(jié)果見圖3和表2。隨著染砷濃度增加，無機砷的濃度也增大，這說明細胞對砷的攝入與染砷濃度成正比。此外在譜圖中還發(fā)現(xiàn)，MMAⅢ的濃度也隨染砷濃度的升高而增大，這說明隨著進入細胞內(nèi)砷濃度的增大，細胞對外源砷的甲基化量呈現(xiàn)增大趨勢。有趣的是， 與這些有規(guī)律的變化相比，細胞內(nèi)的DMAⅤ和MMAⅤ的含量呈現(xiàn)出不規(guī)律變化。由砷代謝模式可知[13]，生物體代謝外源無機砷是在酶和還原性谷胱甘肽參與 圖3 不同染砷濃度下肝細胞中砷形態(tài)譜圖

Fig．3 HPLC-ICP-MS chromatograms of arsenic species in different incubation hepatocytes下由無機形態(tài)砷逐步轉(zhuǎn)化為有機形態(tài)砷，這是個動態(tài)過程，最終產(chǎn)物是自由態(tài)存在的五價甲基砷化物?；诖?，本研究推測DMAⅤ和MMAⅤ含量的不規(guī)律現(xiàn)象可能是由于細胞對砷的甲基化尚未達到終點造成的，即在本次測定進行時，細胞中的砷尚處于由無機砷向甲基砷轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程中，此時大部分的砷處于還原態(tài)的三價甲基砷形態(tài)而未向五價甲基砷轉(zhuǎn)化。因而造成了DMAⅤ和MMAⅤ出現(xiàn)了含量上的不規(guī)律變化。

由于樣品中的各種砷代謝產(chǎn)物含量分布規(guī)律較難把握，為了簡化實驗結(jié)果，本研究用H2O2氧化處理細胞樣品，將還原態(tài)的砷代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為氧化態(tài)，結(jié)果見表2。隨著染砷濃度的增大，無機砷、一甲基砷、二甲基砷 （分別以As、MMAⅤ和DMAⅤ計）的含量呈現(xiàn)增大趨勢。這說明隨著染砷濃度的增高，細胞吸收砷的量呈現(xiàn)增大趨勢。此外，本研究對Chang肝細胞的甲基化率進行了研究。所謂甲基化率是生物體砷代謝生成甲基化產(chǎn)物與總攝入砷的比值，它是反應(yīng)生物體對砷代謝能力的參數(shù)，甲基化率高說明該生物代謝砷的能力強，對外源砷不敏感；甲基化率低說明該生物代謝能力弱，對外源砷敏感。研究顯示，盡管隨著染砷濃度的增加，Chang肝細胞攝入的砷呈現(xiàn)增加趨勢，但其甲基化率卻呈現(xiàn)降低趨勢，說明高染砷濃度會對細胞生物甲基化產(chǎn)生抑制作用。此外，甲基化率23.6%～35.4%也說明Chang肝細胞的甲基化能力較弱。

3.5 形態(tài)分析方法評價

本研究采用質(zhì)量平衡法考察砷形態(tài)分析方法的準確性，見表2中酸消解總砷含量和3種砷形態(tài)之和兩列。對比發(fā)現(xiàn)，這兩組數(shù)據(jù)非常接近，說明本研究所采用的形態(tài)分析方法準確性較高。

表2 Chang肝細胞中砷形態(tài)的質(zhì)量平衡分析（n＝3）

Table 2 Mass balance approach for arsenic speciation in hepatocytes by HPLC-ICPMS（n＝3）

細胞樣品

Hepatocytes酸消解總砷含量a

Total arsenic after

acid digestionSymbolmA@ g/L）H2O2氧化前砷形態(tài)含量

Arsenic speciation before H2O2 treatmentAs

a：The precision is expressed as ±one standard deviation.

此外，形態(tài)分析方法的有效性通過加標(biāo)回收率實驗驗證，在樣品中加入約100%背景濃度的5種砷形態(tài)，測定加標(biāo)后的砷形態(tài)含量并計算回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，5種砷形態(tài)的回收率介于86%～108%之間，滿足定量分析要求。此外，本研究采用逐級稀釋法測定了色譜分析法的檢出限， 6種砷形態(tài)的檢出限介于0.5～0.8 表3 砷形態(tài)分析方法的加標(biāo)回收率及檢出限（n＝3）

Table 3 Spike recovery and detection limits of arsenic species using HPLC-ICPMS（n＝3）

砷形態(tài)

SymbolmA@ g/L）加入量

Added

4 結(jié) 論

本研究利用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)對Chang肝細胞中的砷代謝產(chǎn)物進行分析。研究發(fā)現(xiàn)，Chang肝細胞中存在兩種無法用已有商業(yè)化的砷形態(tài)標(biāo)準表征的砷形態(tài)，結(jié)合文獻及本實驗結(jié)果，推測其中一種為MMAⅢ，另一種為含硫的一甲基砷化物。通過合成標(biāo)準加入法證明了未知峰UN1為MMAⅢ。定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著染砷濃度的增高Chang肝細胞對砷的吸收量增大，而其甲基化率降低，這說明高濃度外源砷對細胞代謝砷的能力有抑制作用。本方法具有較好的準確性，5種砷形態(tài)加標(biāo)回收率介于86%～108%，滿足痕量分析要求。

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CAO Xuan*1， YU Jing-Jing2， GAO YANG1， SUN Ji-Chang1， LIU YAN1，

XU Yuan-Yuan3， SUN Gui-Fan3， WANG Xiao-Ru*2

1（Institute of Oceanographic Instrumentation， Shandong Academy of Sciences，

Shandong Ocean Environment Monitoring Technology Key Lab， Qingdao 266001）

2（First Institute Oceanography of State Oceanic Administration， Qingdao 266061）

3（College of Pubic Health， China Medical University， Shenyang 110001）

Abstract Hyphenated technique of high performance liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry （HPLC-ICP-MS） was applied to the determination of arsenic metabolites in Chang liver cells after arsenic incubation. Two unknown arsenicals were found， one of which was speculated as methylarsonous acid （MMAⅢ）， and further characterized using standard addition method using synthesized MMAⅢ standard. Quantitative analysis results showed that monomethylarsenicals， dimethylarsenicals and inorganic arsenicals in hepatocytes after arsenic incubation were increasing with the increase of initial incubated arsenic concentration while the methylation rate decreasing with the increase of initial incubated arsenic concentration， which indicated that high concentration of arsenic has the inhibition to the ability of arsenic methylation of Chang liver cells.

Keywords High performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry; High performance liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry; Chang liver cells; Arsenic metabolites; Methylarsonous acid

（Received 21 June 2010; accepted 29 August 2010）