摘 要 利用三維熒光光譜技術(shù)，結(jié)合分別基于自加權(quán)交替三線性分解（SWATLD）和交替歸一加權(quán)殘差（ANWE）算法的二階校正方法，直接快速測定人體樣液中以及萘丁美酮或萘普生干擾共存下奧沙普秦的含量。利用本方法的“二階優(yōu)勢”，在尿液內(nèi)源物質(zhì)及萘丁美酮或萘普生干擾共存下有效地分辨出奧沙普秦的激發(fā)發(fā)射熒光光譜。采用SWATLD和ANWE的二階校正方法得到的復(fù)雜背景下奧沙普秦的回收率令人滿意，同時對本方法的精密度進行了研究。通過分析品質(zhì)因子包括靈敏度（SEN）、選擇性（SEL）、檢出限（LOD）和檢測量（LOQ），評估了這兩種方法的性能，利用t-檢驗和橢圓置信區(qū)間（ECJR）統(tǒng)計方法對結(jié)果進行了校驗。結(jié)果表明，解析準確可靠，方法快速簡便，無需樣品預(yù)處理，成本低廉，為臨床及醫(yī)藥實時快速分析體液中奧沙普秦含量提供了新的定量分析方法。

關(guān)鍵詞 奧沙普秦；三維熒光光譜；二階校正；萘丁美酮；萘普生；自加權(quán)交替三線性分解；交替歸一加權(quán)殘差算法

1 引 言

奧沙普秦（Oxaprozin， OXP）是一種用途廣泛的臨床常用抗炎藥，屬于非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物[1]。它通過抑制環(huán)氧化酶進而抑制前列腺素的合成，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用。然而，過劑量使用該藥會引起胃痛、胃不適、惡心、腹瀉、輕度貧血等不良反應(yīng)[2]，嚴重者可導(dǎo)致胃潰瘍、腎臟毒性。因此，檢測其在人體液中的濃度，對于臨床醫(yī)藥分析和應(yīng)用具有重要意義。

目前，測定人體液中OXP含量的主要方法是高效液相色譜法[3，4]，它借助于色譜分離手段實現(xiàn)藥物的測定。此外還有紫外分光光度法[5]、中和滴定法[6]和褶合光譜法[7]。在上述傳統(tǒng)的分析手段中，若要實現(xiàn)待分析物的準確測定，必須已知待分析物的選擇性信息。如色譜方法需要藥物和背景分離，光譜方法中需要有物質(zhì)的選擇性吸收區(qū)域。運用色譜方法時，其分離能力是其優(yōu)勢，但運用二階校正法的“數(shù)學(xué)分離”功能可以更加簡便快速。由于OXP具有熒光特性，可以利用高靈敏度的熒光方法進行測定。但熒光是一個寬帶光譜，直接測定OXP時存在體液背景光譜與分析物光譜重疊，導(dǎo)致結(jié)果不準確。本實驗利用其熒光特性，利用三維熒光光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)中基于三線性分解算法的二階校正方法，直接實現(xiàn)背景干擾存在下OXP的快速定量測定。

劉佳等[8]運用三維熒光二階校正法對血漿和尿液中柔紅霉素進行了快速測定；王雪梅等[9]運用三維熒光二階校正方法快速檢測了香蕉中雙苯三唑醇含量，這兩種方法均體現(xiàn)了二階校正方法的“二階優(yōu)勢”。本研究利用三維熒光結(jié)合分別基于自加權(quán)交替三線性分解（Self-weighted alternating trilinear decomposition， SWATLD）[10]和交替歸一加權(quán)殘差（Alternating normalization-weighted error， ANWE）[11]算法的二階校正方法，直接定量測定尿液樣中OXP的含量。考察了同類藥物萘丁美酮（Nabumetone， NAB）或萘普生（Naproxen， NAP）干擾共存時OXP在體液樣中含量的直接快速測定問題。

2 方法原理

2.1 三線性成分模型

二階校正中的三線性成分模型基于文獻[12，13]的工作，由于它與朗伯-比爾定律相一致而廣泛應(yīng)用。在熒光分析中，在選定的I個激發(fā)波長、J個發(fā)射波長范圍內(nèi)，對K個樣本進行掃描，得到大小為I×J×K的三維響應(yīng)數(shù)陣，可由三線性模型（1）表示：

xijk＝∑Nn＝1ainbjnckn＋＋eijk， i＝1， 2，…，I；j＝1， 2，…，J；k＝1， 2，…，K（1）

其中，N為體系中有熒光貢獻的總成分數(shù)；xijk為三維響應(yīng)數(shù)陣X中的元素（i，j，k），它表示第k個樣本在激發(fā)波長數(shù)為i、發(fā)射波長數(shù)為j時的熒光強度；ain是相對激發(fā)光譜陣A（I×N）中的元素（i，n）；bjn是相對發(fā)射光譜陣B（J×N）中的元素（j，n）；ckn是相對濃度陣C（K×N）中的元素（k，n）；eijk是三維殘差陣E（I×J×K）中的元素（i，j，k）。對上面所得三維響應(yīng)數(shù)陣進行分解，可得到具有清晰物理意義的唯一解A、B和C。用于分解三維數(shù)陣的算法已有報道[14]。本研究通過以下兩個算法對三維數(shù)陣進行三線性分解。

2.2 自加權(quán)交替三線性分解算法

自加權(quán)交替三線性分解（SWATLD）算法[10]利用下面3個式子對A、B和C進行迭代求解：

cT（k）＝0.5（diagm（B＋XT..kA）./diagm（ATA）＋diagm（A＋X..kB）./diagm（BTB）），k＝1，2，…，K（2）

bT（j）＝0.5（diagm（A＋XT.j.C）./diagm（CTC）＋diagm（C＋X.j.A）./diagm（ATA）），j＝1，2，…，J（3）

aT（i）＝0.5（diagm（C＋XTi..B）./diagm（BTB）＋diagm（B＋Xi..C）./diagm（CTC）），i＝1，2，…，I（4）

2.3 交替歸一加權(quán)殘差三線性分解算法

ANWE算法基于對殘差進行歸一加權(quán)的思想， 設(shè)計了3個目標函數(shù)，通過交替的方式最小化ANWE殘差，從而獲得C， B和A[11]。在固定A和B的前提下，獲得求解C迭代公式如下：

C＝∑Ii＝1XTi..（B＋）TD2Bdiag（a（i））＋∑Jj＝1X.j.（AT）＋D2Adiag（b（j））

∑Ii＝1（DBdiag（a（i）））2＋∑Jj＝1（DAdiag（b（j）））2＋（5）

固定A和C，獲得B的更新式為：

B＝∑Kk＝1XT..K（A＋）TD2Adiag（c（k））＋∑Ii＝1Xi..（CT）＋D2Cdiag（A（i））

∑Kk＝1（DAdiag（c（k）））2＋∑Ii＝1（DCdiag（A（i）））2＋（6）

固定C和B，獲得A的更新式為：

A＝∑Jj＝1XT.j.（C＋）TD2Cdiagb（j））＋∑Kk＝1X..k（BT）＋D2Bdiag（c（k））#8226;

∑Jj＝1（DCdiag（b（j）））2＋∑Kk＝1（DBdiag（c（k）））2＋（7）

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期于麗麗等： 三維熒光二階校正法快速測定人尿樣中奧沙普秦含量

2.4 組分數(shù)的確定

在實際分析過程中，分析體系組分數(shù)經(jīng)常是未知的。因此，數(shù)據(jù)解析前，有必要預(yù)先估計混合體系組分數(shù)。因為若選擇的組分數(shù)小于真實的組分數(shù)時，則得不到具有實際物理意義的解。只有估計的組分數(shù)不小于真實的組分數(shù)時，算法才能得到具有實際物理意義的解析結(jié)果。本研究采用加一法（ADD-ONE-UP）[15]與核一致診斷法（CORCONDIA）[16]估計體系的組分數(shù)。

2.5 品質(zhì)因子

通常用靈敏度（SEN）、選擇性（SEL）、檢出限（LOD）、檢出量（LOQ）等參數(shù)評估方法的性能。靈敏度（SEN）是指單位濃度純分析信號；選擇性（SEL）是靈敏度與總信號的比值。由公式（8）和（9）[17]計算：

SEN＝k（ATA）－1*（BTB）－1－1/2nn（8）

SEL＝（ATA）－1*（BTB）－1－1/2nn（9）

其中，nn表示矩陣中的（n， n）個元素， *表示Hadamard積，k是單位濃度中組分n的總的信號，k是濃度得分參數(shù)。檢出限和定量下限可分別用3個背景空白樣預(yù)測濃度的標準偏差的3倍和10倍計算。

3 實驗部分

3.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計（日本日立公司），所有檢測均使用1 cm石英比色皿進行激發(fā)發(fā)射掃描。

奧沙普秦、萘丁美酮與萘普生（湖南省藥品生物制品檢定所）; 尿液來自未服該藥的健康志愿者，實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

3.2 實驗用儲備液及人工合成樣的配制

3.2.1 儲備液和工作液的配制 分別精確稱取OXP標準品10.00 mg、NAP標準品1.93 mg及NAB標準品1.92 mg，用無水乙醇溶解后，以水定容至100 mL棕色容量瓶中，作為儲備液，儲存于4 ℃冰箱中。實驗時取1 mL OXP儲備液，用水稀釋至100 mL，作為工作液。NAB與NAP取儲備液做工作液。

3.3.2 校正樣的配制 取7個10 mL容量瓶，編號為1～7號，分別加入不同體積的OXP工作液，并用水定容。作為校正樣本，其濃度分別為80，120，160，200，240，280和320 SymbolmA@ g/L。

3.3.3 驗證樣的配制 取14個10 mL容量瓶，編號為8～21號。在8～13號容量瓶中分別加入不同體積的OXP，在14 ～17號容量瓶中分別加入不同體積的OXP及適量NAB，在18 ～21號容量瓶中分別加入不同體積的OXP及適量NAP。最后用水定容，其濃度見表1。

表1 人工合成樣中OXP的預(yù)測結(jié)果

Table 1 Predicted concentration of oxaprozin （OXP） in synthetic samples

樣本

Sample加入各物質(zhì)的濃度 Added （SymbolmA@ g/L） OXP NABNAP預(yù)測濃度

Predicted concentration （SymbolmA@ g/L）SWATLDANWE回收率 Recovery （% ）SWATLDANWE

8#100－－104.5104.5104.5104.59#140－－148.5148.5106.1106.1

10#180－－193.0193.0107.2107.2

11#220－－230.0230.0104.6104.6

12#260－－269.2269.2103.6103.6

13#300－－303.7303.7101.2101.2

平均回收率（%）Average recovery104.5±2.1104.5±2.1

14#180960－176.3176.498.098.0

15#220960－217.7217.699.098.9

16#260960－252.8252.497.297.1

17#300960－294.0294.098.098.0

平均回收率（%）Average recovery98.1±0.798.0±0.8

18#180－96.5185.0185.9102.7103.1

19#220－96.5223.9223.7101.8101.7

20#260－96.5261.1260.4100.4100.1

21#300－96.5302.8303.0100.9101.0

平均回收率（%）Average recovery101.5±1.0101.5±1.3 NAB: Nabumetone; NAP: Naproxen; SWATLD: Self-weighted alternationg trilinear decomposition; ANWE: Alternating normalization.

3.3 實際樣品的配制

3.3.1 尿液樣中OXP的配制 取6個10 mL容量瓶，編號為22～27號，分別加入不同體積的OXP及適量體積的尿液，并用水定容，其濃度見表2。

表2 分別基于SWATLD與ANWE算法的二階校正方法結(jié)合激發(fā)發(fā)射矩陣熒光得到的尿液樣中OXP預(yù)測結(jié)果

Table 2 Determination of oxaprozin contents in urine samples using SWATLD/ANWE-based second-order calibration coupled with excitation-emission matrix fluorescence

樣本

Sample實際濃度Concentration

SymbolmA@ g/L）預(yù)測濃度 Predicted concentration （SymbolmA@ g/L）SWATLDANWE回收率 Recovery （%）SWATLDANWE

t-檢驗（t-test）1.222.89 RMSEP: root mean square error of prediction.

3.3.2 同類藥物共存下尿液樣中OXP的配制 取8個10 mL容量瓶，編號為28～35號。在29 ～31號容量瓶中分別加入不同體積的OXP及適量NAB，再加入適量尿液；在32 ～35號容量瓶中分別加入不同體積的OXP及適量NAP，再加入適量尿液。用水定容，其濃度見表3。

表3 藥物干擾共存下兩種算法結(jié)合激發(fā)發(fā)射矩陣熒光得到的尿液樣中OXP預(yù)測結(jié)果

Table 3 Determination results of oxaprozin contents in urine samples even in the presence of drug interferences using both two algorithms and excitation-emission matrix fluorescence

樣本

平均回收率 Average recovery （%）94.9±4.8100.2±4.6

t-檢驗 （t-test）2.260.08

3.4 實驗參數(shù)設(shè)置

選取激發(fā)波長范圍242～330 nm，發(fā)射波長范圍為344～420 nm，均為每間隔2 nm取一個數(shù)據(jù)，狹縫寬度設(shè)為5.0/5.0 nm，掃描速度為2400 nm/min。數(shù)據(jù)處理采用本室驗室自編的算法，在Matlab環(huán)境下完成。對以上樣品進行三維熒光掃描，并以水為空白樣本，掃描3次。數(shù)據(jù)處理時扣除空白樣品響應(yīng)平均值。

4 結(jié)果與討論

4.1 人工合成樣中OXP的定量分析

估計由校正樣和驗證樣所組成的人工合成樣數(shù)陣的組分數(shù)，采用核一致估計8～13號組成的驗證樣的組分數(shù)為1，這個組分是OXP貢獻的。由于14～17號和18～21號分別加入了NAB和NAP，因此采用核一致估計的組分數(shù)均為2。采用SWATLD和ANWE解析人工合成樣中OXP的預(yù)測濃度，預(yù)測結(jié)果見表1，由表1可知，兩種算法的預(yù)測濃度與實際添加的OXP濃度相近，即使在有藥物干擾時所得的回收率仍然令人滿意，表明模型預(yù)測結(jié)果可靠。

4.2 尿液樣中OXP的熒光光譜分辨及定量分析

在尿液樣體系中由核一致法對組分數(shù)進行估計，所得組分數(shù)為2。利用SWATLD和ANWE兩種二階校正方法對所獲得的尿液樣中OXP熒光光譜數(shù)據(jù)進行解析，得到OXP的光譜圖。結(jié)果表明，尿液樣內(nèi)源熒光物質(zhì)的熒光光譜與待測物OXP的熒光光譜重疊很嚴重，在這種情況下，運用常規(guī)的熒光方法難以對尿液樣中OXP進行直接定量測定；采用三維熒光結(jié)合三線性分解算法解析，可以準確分辨出OXP的熒光激發(fā)發(fā)射光譜，從分辨的光譜圖中可以看出分辨得到的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與真實的光譜相似。

由解析所得OXP相對濃度對校正樣中的真實濃度回歸，得出校正曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9980（SWATLD）和0.9982（ANWE），表明線性相關(guān)性良好。該線性方程結(jié)合解析出的預(yù)測樣的相對濃度，得出尿液樣中OXP的濃度（見表2）。兩種方法預(yù)測OXP在尿液樣中的回收率分別為（101.7±3.4）%和（96.2±3.3）%。t-檢驗表明在置信度為95%時，SWATLD的結(jié)果令人滿意；在置信度為90%時，ANWE的結(jié)果可以接受。

4.3 同類藥物干擾共存下尿液樣中OXP的熒光光譜分辨及定量分析

在實際用藥時，藥物聯(lián)用是非常普遍的現(xiàn)象。OXP在臨床中常與NAB和NAP聯(lián)用。這兩種物質(zhì)的存在對OXP的直接準確定量分析會產(chǎn)生影響。本研究分別考察了在NAB和NAP作為干擾共存時，尿液樣中OXP的光譜分辨及定量測定，由加一法估計奈丁美酮存在時，尿液體系的組分數(shù)為3。NAP存在時，尿液體系的組分數(shù)為3。利用SWATLD和ANWE對兩組數(shù)據(jù)進行解析。分辨所得光譜圖見圖1和圖2。

圖1 NAB干擾共存時， 用兩種方法分辨得到的尿液樣激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（N＝3）

Fig．1 Ｅxcitation spectral profiles and emission spectral profiles with N＝3 with nabumetone interference in urine samples usingtwo algorithms：a1—b1 SWATLD; a2—b2 ANWE。 1. 真實的（Actual）; 2. 分辨得到的（Resolved）; 3. 分辨得到的背景（Background）; 4. NAB光譜（Nabumetone spectra profiles）

圖2 NAP干擾共存時， 用兩種方法分辨得到的尿液樣激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（N＝3）

Fig．2 Ｅxcitation spectral profiles and emission spectral profiles with N＝3 with naproxen interference in urine samples using two algorithms：a1—b1 SWATLD; a2—b2ANWE。1． 真實的（Actual）; 2． 分辨得到的（Resolved）; 3． 分辨得到的背景（Background）; 4． NAP光譜（Naproxen spectra profiles）\\.

盡管兩種算法解析背景有差異，但解析OXP光譜與真實光譜一致。二階校正定量結(jié)果見表3，在NAB存在時，尿液樣中OXP的回收率分別為（102.0±6.0）%（SWATLD）和（101.5±4.5）%（ANWE）。在NAP存在時，所得回收率分別為（94.9±4.8）%（SWATLD）和（100.2±4.6）%（ANWE）。t-檢驗表明兩種方法所得結(jié)果在置信度水平95%下可信。

4.4 品質(zhì)因子和橢圓置信區(qū)間

尿液背景中OXP運用兩種方法分析的品質(zhì)因子（見表4）和準確度（見圖3）。由SWATLD和ANWE算法得到尿液樣中的LOD分別為0.42和1.69 SymbolmA@ g/L，低于已報道的液相色譜方法檢出限。為進一步考察所用算法的準確程度，對實際濃度與預(yù)測濃度進行了線性回歸分析[18]，基于橢圓置信區(qū)間測試[19]，將計算得到的截距和斜率與理想值0和1進行比較，繪出SWATLD和ANWE算法的橢圓置信區(qū)間（EJCR）。結(jié)果表明，理想點（0，1）都包含在算法預(yù)測結(jié)果的橢圓之中，兩種算法的性能均令人滿意。

圖3 兩種二階校正方法的橢圓置信區(qū)間

Fig．3 Elliptical joint confidence region of two second-order calibration methods

ANWE（—） and SWATLD（）

表4 兩種算法的品質(zhì)因子

Table 4 Figures of merit in urine samples using two methods

品質(zhì)因子 （FOM）SWATLDANWE

靈敏度 Sensitivity （L/SymbolmA@ g） 4.123.42

選擇性 Selectivity0.170.14

檢出限 LOD （SymbolmA@ g/L）0.421.69

定量下限 LOQ （

SymbolmA@ g/L）1.265.13

4.5 方法的精密度實驗

實驗過程中配制OXP濃度分別為180， 220和260 SymbolmA@ g/L，在不同的時間加入不同體積的尿液的測其含量，對樣品進行了精密度（n＝3）實驗。兩種算法解析得到的相對標準偏差（RSD）均小于5%，說明本方法精密度良好，結(jié)果見表5。

2.5 SD： 標準偏差（Standard deviation）；RSD： 相對標準偏差（Ｒelative standard deviation）。

5 結(jié) 論

采用三維熒光光譜技術(shù)結(jié)合分別基于自加權(quán)交替三線性分解（SWATLD）和交替歸一加權(quán)殘差（ANWE）算法的兩種二階校正方法，直接定量測定了人尿液樣中奧沙普秦（OXP）的含量。本方法樣品預(yù)處理簡單，且能夠快速、準確地實現(xiàn)尿液內(nèi)源及聯(lián)用藥物干擾下奧沙普秦（OXP）的定量分析， 實驗結(jié)果令人滿意，為臨床檢測體液中奧沙普秦（OXP）含量提供了一種簡單快速的測定方法。

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19 González A G， Herrador M A， Asuero A G.Talanta， 1999， 48（3）: 729～736

Rapid Determination of Oxaprozin Contents in Urine and Combined

Pharmacotherapy Samples Using Three-dimensional Fluorescence

Coupled with Second-order Calibration Methods

YU Li-Li， WU Hai-Long*， FU Hai-Yan， YU Yong-Jie， LIU Ya-Juan， QING Xiang-Dong， YU Ru-Qin

（State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics， Hunan University， Changsha 410082）

Abstract A new and effective approach was developed for the quantitative analysis of oxaprozin in human urine samples by the incorporation of excitation-emission matrix fluorescence （EEM） and second-order calibration methodologies based on self-weighted alternating trilinear decomposition （SWATLD） and alternating normalization-weighted error （ANWE） algorithms， respectively. With the application of a second-order advantage， excitation spectral profiles and emission spectral profiles of oxaprozin were effectively resoluted， even in the presence of urine and other homogeneous drugs such as nabumetone or naproxen. The average recoveries of oxaprozin in urine samples and the precision of test results are satisfactory. In addition， the accuracy of these two algorithms was also evaluated through figures of merit， such as sensitivity （SEN）， selectivity （SEL）， limit of detection （LOD） and limit of quanti-ication （LOQ）. Both methods were verified by t-test and the elliptical joint confidence region. The results show that both algorithms were accurate and reliable. The method is simple， without previous separation procedure.

Keywords Oxaprozin; Three-dimensional fluorescence spectroscopy; Second-order calibration; Nabumetone; Naproxen; Self-weighted alternating trilinear decomposition; Alternating normalization-weighted error

（Received 16 May 2010; accepted 9 September 2010）