摘 要 以鑭摻雜二氧化鈦/沸石吸附劑微柱為萃取裝置，建立了溶菌酶的分光光度檢測法?？疾炝藢嶒灄l件對萃取效率的影響。以甲醇為洗脫液，流速2.0 mL/min；樣品的pH ＝5.0，流速1.2 mL/min，體積1.2 mL；檢測波長280 nm。對蛋清、蜂蜜及葡萄酒中溶菌酶的含量進行了測定，日內與日間精密度分別為2.1%和2.8%；加標回收率＞90%。結果表明， 建立的鑭摻雜二氧化鈦/沸石微柱在線預富集-分光光度法具備簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點，適合于蛋清、蜂蜜及葡萄酒中溶菌酶的測定。

關鍵詞 鑭摻雜二氧化鈦/沸石；微柱；分光光度法；溶菌酶

1 引 言

作為一種吸附材料，沸石在催化、吸附和離子交換領域起著重要的作用[1]。天然沸石所含雜質成分復雜，表面硅氧結構具有極強的親水性，且結構外部陽離子易水解，導致其吸附能力達不到要求?？梢詫Ψ惺M行改性或摻雜處理。已報道的方法有降低硅鋁比改性[2]、堿金屬改性[3]、納米TiO2材料改性[4～7]等。其中，納米TiO2材料具有比表面積大、化學穩(wěn)定性高、無毒、成本低等優(yōu)點，得到了廣泛關注。如用TiO2改性沸石，可以提高沸石對甲基橙等有機物的吸附能力[5]。研究表明，金屬離子摻雜可以增強TiO2對目標物的吸附。

溶菌酶廣泛存在于動物體液、禽類蛋白及植物中，具有抗菌、抗病毒等功效。溶菌酶是蛋清中最主要的蛋白質，約占3.5%；是蜂蜜的特有成分，具有溶細菌的作用；是低度酒的良好防腐劑，可防止產酸菌的生長[8，9]。因此，對溶菌酶的測定十分重要[10，11]。由于溶菌酶在實際樣品中的含量通常很低，雜質干擾嚴重，難以直接測定。因此，對樣品進行預富集是必不可少的步驟。目前，用于溶菌酶分離的方法有電泳法[12]、色譜法[13]、沉淀法[14] 和固相萃取法[10，15～19]。其中，固相萃取法操作簡便， 分析速度快， 無環(huán)境污染， 可與現(xiàn)代分析技術聯(lián)用。吸附劑的選擇是固相萃取的關鍵[16]，已報道的溶菌酶的吸附劑有殼聚糖衍生物[17]、交換樹脂[18]、牛血清白蛋白-脲醛樹脂-ZrO2[19]等。

稀土摻雜TiO2可以增大TiO2比表面積，對有機物有強吸附作用。本實驗制備了La3＋-TiO2/沸石吸附劑，用于溶菌酶的在線分光光度檢測，并測定了蛋清、蜂蜜及葡萄酒中的溶菌酶含量。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TU 1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）；HL-2D恒流泵（上海青浦滬西儀器廠）；pH-3SC酸度計（上海雷磁儀器廠）；KQ2200DB數(shù)控超聲清洗器（江蘇昆山超聲儀器公司）；79-1磁力攪拌器（常州國華公司）；DGG-9070AD電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器公司）；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；層析柱（50 mm×3 mm i.d.，上海北昂科學儀器公司）。溶菌酶（優(yōu)級純，Sigma公司）；天然沸石采自吉林省九臺市，粒徑為0.20 mm，主要成分及含量（%）：SiO2（70.96）， Al2O3（12.17）， CaO（3.52）， MgO（1.24）， K2O（2.93）， Na2O（0.52）和其它（8.66）；La2O3 （光譜純）；鈦酸丁酯和無水乙醇（優(yōu)級純，北京化工廠）；甲醇（色譜純，SK Chemicals公司）；NaH2PO4、 Na2HPO4、 NaCl、 NaHCO3、Na2CO3、濃HNO3、 HCl、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、正丙醇均為分析純。

2.2 稀土離子摻雜TiO2/沸石復合物的制備

2.2.1 沸石的預處理稱取沸石0.50 g，加入50 mL 1.0% HCl，攪拌3.0～3.5 h，過濾，用蒸餾水洗至濾液呈中性后，60 ℃烘干備用。

2.2.2 溶膠的制備 量取40 mL無水乙醇，加入10 mL鈦酸丁酯和1 mL HNO3， 攪拌5 min，得溶膠A；準確稱取0.1436 g La2O3，加入2 mL濃HCl和48 mL水溶解。將溶膠A在攪拌下逐滴（1 d/s）加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌30 min，得到摻雜B溶膠，放置12 h以上待用。

2.2.3 La3＋摻雜TiO2/沸石復合物的制備 將預處理過的沸石置于燒杯中，使其基本覆蓋杯底，用少量水潤濕，然后烘至無水。量取B溶膠15 mL，逐滴加入到上面沸石中至基本覆蓋時，烘干，得La3＋摻雜TiO2/沸石復合物樣品。

2.3 實驗流路設置和測量步驟

將La3＋-TiO2/沸石吸附劑填充到層析柱中，用去離子水充分沖洗微柱。在線固相萃取的流路由恒流泵和固相萃取微柱組成，在280 nm處測定溶菌酶的濃度。

用去離子水沖洗微柱后，引入參比溶液，然后引入溶菌酶樣品，使其流經微柱進行富集。富集后用緩沖溶液清洗微柱，最后引入洗脫液（甲醇）， 將溶菌酶洗脫下來，測定吸光度。

分 析 化 學第39卷

第1期田苗苗等： 鑭摻雜二氧化鈦/沸石微柱在線預富集-分光光度法測定溶菌酶含量

3 結果與討論

3.1 La3＋摻雜TiO2/沸石復合物的表面形貌特征

圖1是沸石原樣及La3＋-TiO2/沸石復合物的掃描電鏡圖。由圖1a可見，沸石原樣表面凹凸不平且附著小顆粒，有明顯的大小孔洞；La3＋-TiO2/沸石復合物（圖1b）表面比較光滑平整，未見明顯的孔洞，也無顆粒附著，說明La3＋摻雜的TiO2已均勻地負載在沸石表面并進入孔洞中，達到了理想的負載效果。

圖1 沸石（a）及La3＋-TiO2/沸石復合物（b）的掃描電鏡圖

Fig．1 SEM images of （a） zeolite and （b） zeolite modified with La3＋ doped TiO2

3.2 洗脫液種類的選擇

分別以二次蒸餾水、NaCl溶液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl-正丙醇、碳酸鹽緩沖液及甲醇為洗脫液，比較各種洗脫液對溶菌酶的洗脫效果。結果表明，甲醇洗脫效果最好。

3.3 萃取條件的優(yōu)化

3.3.1 樣品溶液pH值的優(yōu)化 用HCl或NaOH調節(jié)樣品的pH值，在pH 1.0～11.0范圍內，考察了pH值對萃取效率的影響。由圖2a可見，當pH值從1.0增加到5.0時，吸光度值隨著pH值的升高而增大；而當pH＞5.0時，吸光度值隨著pH值的升高而降低。這是因為用摻雜La3＋的TiO2對沸石進行改性后，其對有機物的吸附能力主要取決于有機物分子大小。隨著分子直徑的增大，被吸附進入空穴的機會逐漸減少。沸石與分子量小的有機物作用時，吸附起主要作用；沸石與分子量大的有機物作用時，離子交換和吸附共同作用，但以離子交換為主。溶菌酶屬于分子量大的有機物，所以兩者間的作用以離子交換為主。本實驗采用溶膠-凝膠法，以摻雜La3＋的TiO2對沸石進行改性，這樣可以形成超細的固體吸附劑顆粒，從而提高了吸附能力及陽離子交換能力。溶菌酶的等電點很高 （pI＝11.0），在接近中性的條件下，溶菌酶帶正電荷，所以通過陽離子交換作用很容易吸附溶菌酶。本實驗中樣品溶液pH＝5.0。

3.3.2樣品流速的優(yōu)化

固定其它條件，考察樣品流速對萃取效率的影響（圖2b）。當樣品流速處于0.6～1.0 mL/min時，對吸光度影響不大；樣品流速增加到1.2 mL/min時，吸光度增大至最高值；隨后，吸光度下降。這是因為樣品流速過快，會導致吸附不完全；流速過慢，會造成分離時間過長，且吸收峰變寬。所以，本研究中樣品流速選擇為1.2 mL/min。

3.3.3樣品體積的優(yōu)化 從圖2c可見，當樣品體積在0.2～1.2 mL范圍內時，吸光度有所增大，但當樣品體積大于1.2 mL時，由于微柱對溶菌酶基本吸附完全，吸光度值無明顯變化。但樣品體積過大，導致分析時間延長。本實驗樣品進樣體積選擇為1.2 mL。

圖2 樣品pH值（a）、樣品流速（b）和樣品體積（c）的影響

Fig．2 Effect of sample pH value （a）， sample flow rate （b） and sample volume （c）

溶菌酶（Lysozyme）： 40 mg/L；洗脫液（Eluent）： 甲醇（Methanol）；洗脫液流速（Eluent flow rate）： 2.4 mL/min; a: 樣品流速（Sample flow rate）： 1.2 mL/min；樣品體積（Sample volume），1.2 mL；b: pH， 5.0；樣品體積（Sample volume）， 1.2 mL；c: pH， 5.0；樣品流速（Sample flow rate）， 1.2 mL/min。

3.3.4 洗脫液流速的優(yōu)化

確定樣品pH值、樣品流速、樣品體積等條件，在1.2～2.4 mL/min范圍內，考察了洗脫液流速的影響。洗脫液流速過小，會造成吸收峰拖尾；當流速為2.0 mL/min時，洗脫效果最好。本實驗洗脫液流速為2.0 mL/min。

3.4 方法評價及實際樣品分析

3.4.1 方法評價 在上述優(yōu)化的實驗條件下（洗脫液：甲醇；樣品pH＝5.0；樣品流速：1.2 mL/min；樣品體積：1.2 mL；洗脫液流速：2.0 mL/min），微柱對溶菌酶的萃取、洗脫和檢測在5 min內能夠完成。

將優(yōu)化的實驗條件用于10～100 mg/L的溶菌酶的測定，線性方程為A＝0.006c＋0.0141，R2＝09959。以3倍信噪比進行計算得檢出限（LOD）為0.079 mg/L。在測量次數(shù)均為5次時，方法的日內和日間（連續(xù)3 d）精密度分別為2.1%和2.8%。證明本方法的靈敏度和精密度均較高。

3.4.2 實際樣品分析 取1 g蛋清（用兩層紗布濾除蛋清中的臍帶等不溶物）溶于100 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）中，得10 g/L蛋清溶液，超聲，在4 ℃以1000 r/min離心30 min，取上清液，進樣。分別取1 g蜂蜜和葡萄酒，溶于50 mL Tris-HCl溶液中，得20 g/L的蜂蜜、葡萄酒溶液，重復上述超聲、離心操作，取上清液，進樣。對蛋清、蜂蜜、葡萄酒（各5種樣品）進行加標回收率的測定（加標值分別為50，10和5 mg/L），結果如表1所示。加標回收率在90.6%～98.2%之間，結果令人滿意。

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Spectrophotometric Determination of Lysozyme by

On-line Preconcentration with A Microcolumn

Containing La3＋-TiO2-Zeolite

TIAN Miao-Miao， SU Ri-Ｙan， JIA Qiong*， BAO Chang-Li， QUAN Xin-Jun

（College of Chemistry， Jilin University， Changchun 130022）

Abstract A spectrophotometric method for the determination of lysozyme was established based on the on-line preconcentration with a La3＋-TiO2-zeolite microcolumn. Effects of operation parameters on the extraction efficiency were optimized as follows: methanol as the eluent with a flow rate of 2.0 mL/min， sample pH of 5.0， sample flow rate of 1.2 mL/min， sample volume of 1.2 mL， and detection wavelength of 280 nm. The proposed method was employed for the determination of lysozyme in egg white， honey， and wine samples. The relative standard deviations of intra-day and inter-day were determined as 2.1% and 2.8%， respectively. The recoveries were higher than 90%. The method is simple， rapid， sensitive.

Keywords Lanthanum-titamium oxide-zeolite; Microcolumn; Spectrophotometry; Lysozyme

（Received 6 July 2010; accepted 11 August 2010）