摘 要 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀對磷脂類分子在小鼠肝組織中的分布進行了研究，建立了質(zhì)譜成像技術(shù)檢測小鼠肝組織中磷脂類分子分布的分析方法。以7 g/L α-腈基-4-羥基肉桂酸的50%甲醇溶液（含0.2%三氟乙酸）作為基質(zhì)，采用正離子采集模式，準(zhǔn)確鑒定了5類13種磷脂類分子，其分子量主要分布在700～900 Da之間，且觀察到它們在組織內(nèi)分布呈現(xiàn)不均勻性。本研究表明，以超高分辨和超高精度的質(zhì)譜儀開展組織成像研究， 不僅可以探究脂類分子在組織中的分布，而且可以直接準(zhǔn)確鑒定相關(guān)分子，真正實現(xiàn)分子水平上的組織成像。

關(guān)鍵詞 質(zhì)譜成像；基質(zhì)輔助激光解吸電離-傅里立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法；肝組織；磷脂

1 引 言

質(zhì)譜成像技術(shù)[1]是以基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)出的一種新型組織內(nèi)分子成像技術(shù)。該技術(shù)可以在分子水平上對生物組織內(nèi)的分子“直接”分析，經(jīng)過圖像重建軟件獲得組織內(nèi)分子的定位、定性和定量信息，其檢測對象包括內(nèi)源性小分子[2～4]、藥物代謝產(chǎn)物[5～8]、多肽[9～11]和蛋白質(zhì)[12～15]等。脂類分子是一大類重要的生命基礎(chǔ)物質(zhì)，是生物體質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，同時作為細胞信號分子參與生物體內(nèi)的諸多生理活動。研究表明，脂類的異常代謝和分布與疾病相關(guān)，如胰島素抗藥性糖尿病、阿爾海默病、癌癥和感染性疾病等[16]。本研究利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（MALDI-FTICR MS） 研究了小鼠肝組織中的磷脂類分子的分布及其豐度變化，對分子進行了準(zhǔn)確鑒定，真正實現(xiàn)了分子水平上的組織成像分析。2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

9.4 T Apex-UltraTM Hybrid Qq-FTICR MS質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）；Synergy UV超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；CM 1900冷凍切片機（德國萊卡公司）；Image Prep基質(zhì)覆蓋儀（德國布魯克公司）；真空凍干機（美國西盟公司）。

甲醇（色譜純，美國飛世爾科技公司）；三氟乙酸（TFA，色譜純，美國天地試劑公司）；標(biāo)準(zhǔn)品Peptide calibration standard Ⅱ（德國布魯克公司）；包被氧化銦錫（ITO）載玻片；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）。

6周齡c57小鼠（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品及基質(zhì)溶液的配制

0.5 SymbolmA@ mol/L標(biāo)準(zhǔn)品溶解于125 SymbolmA@ L 0.1% TFA溶液中，振蕩混勻30 s，分裝后置于－20 ℃保存。準(zhǔn)確稱取0.105 g CHCA基質(zhì)兩份，分別溶解于15 mL 50%甲醇和含0.2% TFA的50%甲醇溶液中。

2.3 實驗方法

2.3.1 肝組織樣本的制備 頸椎脫臼法處死小鼠后，立即擇取肝組織，超純水沖洗凈肝組織表面血跡后直接置于50 mL離心管中。離心管底部接觸液氮即開始氣化沸騰，大約保持20 s組織迅速冰結(jié)成塊后轉(zhuǎn)移至于－80 ℃冰箱保存。

2.3.2 組織切片的制備 組織從－80 ℃冰箱轉(zhuǎn)移至CM 1900冷凍切片機，冷凍切片機操作溫度為－20 ℃。連續(xù)獲取相鄰兩個厚度為7

SymbolmA@ m的肝組織切片，分別置于兩個 ITO 載玻片上，然后置于真空干燥機中干燥10 min。利用Image Prep基質(zhì)覆蓋儀對兩個肝組織切片分別噴灑25 mL 兩種基質(zhì)溶液。

2.3.3 質(zhì)譜條件 正離子采集模式；掃描范圍：m/z 100～1500；掃描步長：200 SymbolmA@ m；激光斑點：40 SymbolmA@ m；激光照射點數(shù)：50；每張質(zhì)譜圖累加4次；質(zhì)量校準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)品Peptide mixture進行外標(biāo)法校正，誤差小于2×10－6。Hystar 3.4和Apex Control 3.0質(zhì)譜圖采集軟件， DataAnalysis 4.0質(zhì)譜圖分析軟件， FlexImaging 2.1質(zhì)譜成像軟件由布魯克公司提供。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀的一級質(zhì)譜圖可以準(zhǔn)確測定脂類分子的分子量。通過檢索脂類分子數(shù)據(jù)庫Lipid MAPS（http://www.lipidmaps.org/）鑒定肝組織中的脂類分子。其參數(shù)設(shè)定為：離子強度大于5000；質(zhì)荷比容許誤差：±0.005；離子種類：[M＋H]＋， [M＋Na]＋和[M＋K]＋。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期劉 輝等： 應(yīng)用超高分辨質(zhì)譜成像技術(shù)探究脂類分子在小鼠肝組織中的分布

3 結(jié)果與討論

3.1 基質(zhì)條件的優(yōu)化

以質(zhì)譜峰個數(shù)和強度為優(yōu)化基質(zhì)條件的指標(biāo)，在布魯克公司推薦質(zhì)譜成像的基質(zhì)溶液（含7 g/L CHCA的50%甲醇溶液）的基礎(chǔ)上，考察了基質(zhì)pH值對質(zhì)譜成像質(zhì)量的影響。研究表明，添加0.2% TFA的基質(zhì)溶液可以獲得最佳質(zhì)譜信號，表明組織表面的酸性環(huán)境有利于脂類分子的離子化。

3.2 脂類分子的鑒定

表1為本研究所鑒定的13種脂類分子對應(yīng)的最強的準(zhǔn)分子離子，其分子量主要集中在700～900 Da之間。它們都屬于磷脂類分子，其中包括7種磷脂酰膽堿 （Phosphatidylcholine，PC），1種磷脂酰乙醇胺 （Phosphatidylethanolamine，PE），2種磷脂酰絲氨酸 （Phosphatidylserine，PS），1種磷脂酰甘油 （Phosphatidylglycerol，PG）和2種甘油磷酸脂 （Phosphatidic acid，PA）。磷脂酰膽堿，又稱卵磷脂，嬰兒期其細胞膜含量高達90%，在生命過程中緩慢下降可低至10%[17]。磷脂酰膽堿不僅是細胞膜的主要成分，還參與細胞信號傳導(dǎo)等生理活動。磷脂酰乙醇胺也稱腦磷脂，人體中主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)。有報道稱磷脂酰乙醇胺具有保持膜蛋白正確構(gòu)象的分子伴侶作用[18]；磷脂酰絲氨酸是大腦細胞膜的重要組成成分之一，對大腦神經(jīng)信號的傳導(dǎo)及記憶的形成具有重要調(diào)節(jié)作用[19]。甘油磷脂是機體內(nèi)含量最多的一類磷脂，它除了構(gòu)成生物膜外，還是膽汁和膜表面活性物質(zhì)等的成分之一，并參與細胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)。

表1 在肝組織中鑒定的磷脂類分子（僅給出最強的準(zhǔn)分子離子）

Table 1 Identified phospholipid molecules in mouse liver tissue （the highest quasi-molecular ions in mass spectra are listed）

化合物名（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)*）

Compound name（C∶DB）測量質(zhì)荷比Measured （m/z）理論質(zhì)荷比

Theoretic （m/z）誤差Error準(zhǔn)分子離子

[M＋K]＋ * C: 碳原子數(shù)（Number of Carbons）；DB: 雙鍵數(shù)（Number of double bonds）; PC: Phosphatidylcholine; PE: Phosphatidylethanolamine; PS: Phosphatidylserine; PG: Phosphatidylglycerol; PA: Phosphatidic acid.

3.3 脂類分子定位分析

圖1是肝組織中某一點的質(zhì)譜圖和PC（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)＝34∶1）、PE（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)＝44∶8）、PS（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)＝40∶4）、PG（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)＝28∶2）及PA（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)＝36∶3）5種磷脂分子在小鼠肝組織中的分布信息。由它們在肝組織中的分布圖可知，磷脂分子在肝組織中的分布是不均勻的，這可能是由于肝組織不同區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)和功能不同造成的。圖2為PC（碳原子數(shù)∶雙鍵數(shù)＝34∶2）分子的3種準(zhǔn)分子離子形式[M＋H]＋、[M＋Na]＋和[M＋K]＋在小鼠肝組織中的分布情況，3種準(zhǔn)分子離子形式在肝組織中的分布基本一致。實驗中觀察到不同磷脂分子準(zhǔn)分子離子強度的差異可能與磷脂分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，如表1所示。研究表明，基于MALDI-FTICR MS的質(zhì)譜成像技術(shù)可以直接在小鼠肝組織中準(zhǔn)確鑒定磷脂類分子，并獲得每種磷脂類分子在組織中的分布和豐度的信息。由表1可知，應(yīng)用FTICR MS，在外標(biāo)法情況下鑒定的每種磷脂分子的質(zhì)量誤差均小于0.005 Da。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對表1中的化合物進行了進一步確證。與基于低分辯和中分辨質(zhì)譜儀的組織成像技術(shù)相比，超高分辨、超高準(zhǔn)確度的FTICR MS質(zhì)譜儀可以快速地在組織中發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物、研究藥物代謝途徑、代謝物定位，并可實現(xiàn)實時的定性分析。MALDI-FTICR MS的應(yīng)用減少了化合物的提取及分離步驟，大大簡化了實驗程序，為“直接”在分子水平上觀察組織的病理變化提供了新的技術(shù)手段，可以用于研究不同病理狀態(tài)下組織的微觀變化，獲得疾病相關(guān)分子在組織中的分布、定位及其豐度變化的信息。

圖1 5種磷脂類分子在小鼠肝組織中的分布

Fig．1 Distributions of five phospholipids in mouse liver tissue

圖2 磷脂酰膽堿分子PC（34∶2）的3種準(zhǔn)分子離子形式在肝組織中的分布

Fig．2 Distributions of Quasi-molecular ion of PC （34∶2） in mouse liver tissue

References

1 Caprioli R M， Farmer T B， Gile J． Anal. Chem.，1997， 69（23）: 4751～4760

2 Shimma S， Sugiura Y， Hayasaka T， Hoshikawa Y， Noda T， Setou M. J. Chromatogr. B，2007， 855（1）: 98～103

3 Jackson S N， Ugarov M， Egan T， Post J D， Langlais D， Schultz J A， Woods A S. J. Mass Spectrom.，2007， 42（8）: 1093～1098

4 LIU Nian， LIU Feng， XU Bin， GAO Ya-Bing， LI Xiang-Hong， WEI Kai-Hua， ZHANG Xue-Min， YANG Song-Cheng（劉 念，劉 鋒，許 彬，高亞兵，李向紅，魏開華，張學(xué)敏，楊松成）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2008， 36（4）: 421～ 425

5 Atkinson S J， Loadman P M， Sutton C， Patterson L H， Clench M R. Rapid Commun Mass Spectrom，2007， 21（7）: 1271～1276

6 Cornett D S， Frappier S L， Caprioli R M. Anal. Chem.，2008， 80（14）: 5648～5653

7 Khatib-Shahidi S， Andersson M， Herman J L， Gillespie T A， Caprioli R M. Anal. Chem.，2006， 78（18）: 6448～6456

8 Trim P J， Henson C M， Avery J L， McEwen A， Snel M F， Claude E， Marshall P S， West A， Princivalle A P， Clench M R. Anal. Chem.，2008， 80（22）: 8628～8634

9 DeKeyser S S， Kutz-Naber K K， Schmidt J J， Barrett-Wilt G A， Li L J. J. Proteome. Res.， 2007， 6（5）: 1782～1791

10 Taban I M， Altelaar A F M， Van der Burgt Y E M， McDonnell L A， Heeren R M A， Fuchser J， Baykut， G. J. Am. Soc. Mass Spectrom.，2007， 18（1）: 145～151

11 Verhaert P D， Conaway M C P， Pekar T M， Miller K. Int. J. Mass Spectrom.，2007， 260（2-3）: 177～184

12 Groseclose M R， Andersson M， Hardesty W M， Caprioli R M. J. Mass Spectrom.，2007， 42（2）: 254～262

13 Lemaire R， Desmons A， Tabet J C， Day R， Salzet M， Fournier I. J. Proteome Res.，2007， 6（4）: 1295～1305

14 Cornett D S， Reyzer M L， Chaurand P， Caprioli R M. Nat Methods，2007， 4（10）: 828～833

15 Meistermann H Norris， J L， Aerni， H R， Cornett D S， Friedlein A， Erskine A R， Augustin A， Mudry M C D， Ruepp S， Suter L， Langen H， Caprioli R M， Ducret A. Mol. Cell Proteomics，2006， 5（10）: 1876～1886

16 Oresic M， Hanninen V A， Vidal-Puig A. Trends Biotechnol，2008， 26（12）: 647～652

17 The data from http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphatidylcholine

18 Bogdanov M， Eugenia M， Dowhan W. Subcell Biochem，2008， 49: 197～239

19 Kidd P M. Altern. Med. Rev.，2008， 13（2）: 85～115

Imaging and Identification of Phospholipids in Mouse Liver Tissue by

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Fourier Transform Ion

Cyclotron Resonance Mass Spectrometry Imaging

LIU Hui， CHEN Guo-Qiang， WANG Yan-Ying， LI Zhi-Li*

（Institute of Basic Medical Science Chinese Academy of Medical Science and School of Basic Medicine，

Peking Union Medical College， Beijing 100005）

Abstract Matrix assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry （MALDI-FTICR MS）-based mass spectrometric imaging （MSI） was applied to profile and identify phospholipid molecules in mouse liver tissues， which were cut into tissue sections （7 SymbolmA@ m） on a cryostat at －20 ℃ and covered with 7 g/L of alpha-cyano-4-hydroxycinnamicacid （CHCA） as matrix in 50% methanol/0.2 trifluoroacetic acid solution. 13 phospholipid compounds， which are classified as 5 different species， phosphatidic acid （PA）， phosphatidylcholine （PC）， phosphatidylethanolamine （PE）， phosphatidylglycerol （PG） and phosphatidylserine （PS）， were accurately identified. Their molecular weights are between 700 and 900 Da. The present results indicate that MALDI-FTICR MS-based MSI is a powerful tool to explore the distribution of disease-related molecules and drug metabolites in tissues.

Keywords Mass spectrometric imaging; Matrix assisted laser desorption ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry; Liver tissue; Phospholipid

（Received 21 April 2010; accepted 2 July 2010）