摘 要 采用高能碰撞誘導(dǎo)解離（CID）-負(fù)離子模式基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI TOF MS）區(qū)別wfgD（大腸桿菌O152中O抗原基因簇內(nèi)）編碼的β-1，3-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和wfgD（大腸桿菌O77中O抗原基因簇內(nèi)）編碼的α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物-兩個(gè)脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體。結(jié)果表明: 由高能CID-MALDI TOF 質(zhì)譜圖中產(chǎn)物離子[B3]/[Y3]豐度比率的差別可明確區(qū)別兩個(gè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物。并發(fā)現(xiàn)碰撞能量為1.0 kV時(shí)，碰撞靶氣的壓力變化可影響產(chǎn)物離子[B3]/[Y3]的豐度比率。推斷MALDI-TOF質(zhì)譜圖中，兩個(gè)脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的磷酸二脂鍵部分和糖苷鍵的裂解依賴于糖基給予體的立體化學(xué)。

關(guān)鍵詞 脂寡糖；糖基轉(zhuǎn)移酶；基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜

1 引 言

O抗原是革蘭氏陰性菌外膜的重要成分， 也是免疫系統(tǒng)和抗菌素的主要靶點(diǎn)，O抗原的多樣性對(duì)于細(xì)菌的致病性及在宿主體內(nèi)的生存有重要作用[1]。O抗原由寡糖重復(fù)單位組成，每個(gè)重復(fù)單位通常由2～8個(gè)單糖組成，O-抗原的多樣性主要源于構(gòu)成重復(fù)單位的單糖種類和糖苷鍵鏈接方式的不同。在Ｏ-抗原生物合成過程中， 糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將核苷二磷酸單糖前體上的糖基轉(zhuǎn)移到延伸中的寡糖單位。

盡管糖基轉(zhuǎn)移酶非常重要，但由于編碼此類酶的基因之間的同源性很小，根據(jù)與其它已知基因的比較，只能判斷一個(gè)未知基因是否屬于這類基因，不能判斷其合成的糖苷鍵類別。目前，糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能的明確鑒定主要依賴酶促反應(yīng)產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的正確表征。大部分糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物屬于脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體，由于脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體鑒定和區(qū)分的困難，在純化制備酶促反應(yīng)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，應(yīng)用核磁共振（NMR）技術(shù)僅能明確鑒定少部分假定糖基轉(zhuǎn)移酶的特定功能[2，3]。

理論上，一維和二維NMR技術(shù)是現(xiàn)有測(cè)定糖鏈結(jié)構(gòu)最常用的方法，也是區(qū)分脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體的最有效途徑。但其主要缺點(diǎn)是靈敏度較低，特別是涉及耗時(shí)繁瑣的分離純化制備步驟。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸離子化方式的發(fā)展和成熟為寡糖非對(duì)映異構(gòu)體的區(qū)分提供了技術(shù)平臺(tái)[4，5]。本研究在采用NMR技術(shù)已證明其基因功能的基礎(chǔ)上，以wfgD編碼的β-1，3-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和wfg D編碼的α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物——兩個(gè)脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體為研究對(duì)象，采用高能碰撞誘導(dǎo)解離（CID）-負(fù)離子模式基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS），對(duì)兩個(gè)脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了區(qū)分。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（4700 Applied Biosystems， MA）。甲醇和乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）， α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，F(xiàn)luka公司）， UDP-Glc和GDP-Man（Sigma-Aldrich公司），水為二次蒸餾水。本實(shí)驗(yàn)涉及的菌株、質(zhì)粒、酶及其它生化試劑參見文獻(xiàn)[2]。

2.2 樣品制備

大腸桿菌O77抗原中wfgD 基因和O152抗原中wfgD基因的克隆、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)及酶活反應(yīng)細(xì)胞膜提取物的制備按文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行。由于wfgD和wfgD與細(xì)胞膜之間存在相互作用，本研究以H1517（含wfgD或wfgD基因的重組質(zhì)粒）的細(xì)胞膜部分作為酶的來源進(jìn)行酶促反應(yīng)。

標(biāo)準(zhǔn)40

SymbolmA@ L反應(yīng)體系為：1.0 mmol/L 受體GlcNAc-PP-PhU（空白對(duì)照以二次蒸餾水替代）， 5 mmol/L MnCl2， 75 mmol/L MES 緩沖液（pH 7）， 5 mmol/L GDP-Man（或UDP-Glc）和10 SymbolmA@ Ｌ細(xì)菌膜提取物（含1.0～12 SymbolmA@ g Protein，陰性對(duì)照分別以大腸桿菌DH5α和 BL21替代）。37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后，沸水浴中加熱1 min，12000 r/min離心5 min。將上清稀釋200倍后，取0.3 SymbolmA@ L待測(cè)液與等體積基質(zhì)，滴于樣品探頭靶心，室溫干燥結(jié)晶后直接分析測(cè)試。

wfgD酶促反應(yīng)產(chǎn)物（Glc-

SymbolbA@ -1，3-GalNAc-

SymbolaA@ -PO3-PO3-（CH2）11-OPh）和wfgD酶促反應(yīng)產(chǎn)物（Man-

SymbolaA@ -1，3-GalNAc-

SymbolaA@ -PO3-PO3-（CH2）11-OPh）的結(jié)構(gòu)均由GC-MS， 二維H，H-COSY、TOCSY譜和HRMS等方法確認(rèn)[2]。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別見圖1和圖2中的插圖。

2.3 MALDI-TOF MS分析條件

基質(zhì)為α-CHCA，激光器Nd:YAG， 波長(zhǎng)355 nm， 反射模式，負(fù)離子譜檢測(cè)。串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中， 高能碰撞誘導(dǎo)解離（CID）碰撞小室以空氣為碰撞氣體， 其壓力維持在3.33×10－4 Pa， 碰撞能量1 kV。為方便解析質(zhì)譜，將預(yù)期的酶促反應(yīng)產(chǎn)物苯氧基十一烷基二磷酸二糖視為五糖（寡糖），苯氧基十一烷基和二磷酸基分別代表一個(gè)和兩個(gè)糖環(huán)。所有碎片應(yīng)用Domon-Costello命名法識(shí)別[6]。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期周大煒等: 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法區(qū)分大腸桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶基因

3 結(jié)果與討論

3.1 兩個(gè)脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體的MALDI-TOF MS質(zhì)譜結(jié)果

在負(fù)離子模式下，兩個(gè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體的MALDI-TOF質(zhì)譜都有豐度強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰 m/z 789.2133（m/z 789.2134） [M－H]－， m/z 811.2151（m/z 811.2138） [M＋Na－Ｈ]－峰的強(qiáng)度非常弱（圖略）。

3.2 兩個(gè)脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體的MALDI-CID 質(zhì)譜結(jié)果

圖1和圖2分別給出了負(fù)離子模式下兩個(gè)脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體分子離子的二級(jí)質(zhì)譜圖。以wfgD催化反應(yīng)產(chǎn)物為例，以m/z 789.2133 [Ｍ－Ｈ]－為前驅(qū)離子， 觀察到4個(gè)源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子為m/z 444.5749 [B3]， 524.6265 [B4]， 462.6034 [C3]和405.5491 [Z3]; 源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子有m/z 241.2966 [Y4]和423.5699 [Y3]; 源于磷酸二脂鍵部分兩個(gè)鍵同時(shí)碎裂的產(chǎn)物離子有m/z 791739 [PO3]－ 和159.0979 [HPO3PO3]－; 未發(fā)現(xiàn)涉及開環(huán)的產(chǎn)物離子。 圖1 wfgD催化反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-CID 質(zhì)譜圖

Fig．1 MALDI-collision induced disociation（CID） mass spectrum of wfgD product

圖2 wabD催化反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-CID 譜圖

Fig．2 MALDI-CID spectrum of wabD product

根據(jù)圖1和圖2中產(chǎn)物離子相對(duì)豐度可較容易區(qū)分兩個(gè)脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體。wfgD催化反應(yīng)產(chǎn)物（異頭碳的構(gòu)型為β， C2直立羥基）的m/z 444.5749 [B3]/m/z 423.5699 [Y3] 的比率為5.5（圖1），遠(yuǎn)高于wfgD催化反應(yīng)產(chǎn)物（異頭碳的構(gòu)型為

SymbolaA@ ， C2平伏羥基）的比率1.38（圖2）。此外，wfgD催化反應(yīng)產(chǎn)物含有分子離子脫去一個(gè)H3PO4分子的峰m/z 691.1074 [Ｍ－Ｈ－Ｈ3PO4]，而wfgD催化反應(yīng)產(chǎn)物未見此峰。

在儀器許可范圍內(nèi)，碰撞能量保持恒定（1 kV）前提下，考察了碰撞室中靶氣（空氣）壓力對(duì)上述兩個(gè)特征子離子間豐度比率的影響。當(dāng)CID碰撞室中靶氣壓力維持在1.67×10－4 Pa情況下， wfgD催化產(chǎn)物上述兩個(gè)特征子離子豐度的比率（4.0， 圖3a）稍低于wfgD催化產(chǎn)物的比率（5.1， 圖3b）；CID關(guān)閉條件下，兩個(gè)脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的源后裂解（PSD）譜中，wfgD催化產(chǎn)物上述兩個(gè)特征子離子豐度的比率（4.0， 圖4a）略高于wfgD催化產(chǎn)物的比率（3.0， 圖4b）。研究表明，碰撞室中靶氣壓力對(duì)碎裂離子的豐度有很大影響，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。即使碰撞室中靶氣壓力發(fā)生變化，根據(jù)兩個(gè)譜圖（圖3和圖4）中產(chǎn)物離子相對(duì)豐度仍可較容易區(qū)分兩個(gè)脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體。綜上可知，給予體糖環(huán)的C2上羥基構(gòu)型的變化和脂寡糖異頭碳的構(gòu)型對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物脂寡糖磷酸二脂鍵部分和糖苷鍵的穩(wěn)定性有一定影響。

圖3 wfgD（a）和wabD（b）催化產(chǎn)物的MALDI-CID譜

Fig．3 MALDI-CID spectrums of wfgD（a） and wabD （b） product

圖4 wfgD（a）和wabD（b）催化產(chǎn)物的MALDI-PSD譜

Fig．4 MALDI-PSD spectrums of wfgD（a） and wabD（b）product

3.3 小結(jié)

從以上譜圖可見，豐度較大的峰源于磷酸二脂鍵部分的斷裂，糖苷鍵裂解產(chǎn)生的產(chǎn)物離子信號(hào)非常弱，未觀測(cè)到開環(huán)裂解產(chǎn)物離子。CID MALDI-TOF 技術(shù)非常適于區(qū)分pmol水平的脂寡糖非對(duì)映異構(gòu)體。探索簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快捷和靈敏的脂寡糖非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體質(zhì)譜區(qū)分方法，對(duì)Ｏ-抗原生物合成路徑中細(xì)菌糖基轉(zhuǎn)移酶特定功能的高通量準(zhǔn)確鑒定有重要意義。

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Differentiation of Specific Function of Glycosyltransferase Gene by

Matrix Assisted Laser Desorption-Time of FIight-Mass Spectrometry

ZHOU Da-Wei*1，2，3， LIU Bin1，2，3， WU Jun-Li1，2，3， HU Bo1， QI Yuan-Yuan1

（TEDA School of Biological Sciences and Biotechnology， Nankai University1， The Engineering and

Research Center for Microbial Functional Genomics and Detection Technology， Ministry of Education2，

The Key laboratory of Molecular Microbiology and Technology， Ministry of Education3， Tianjin 300457）

AbstractThe glycosyltransferases（GTs） assembling the O-chain utilize lipid-linked acceptor substrates and nucleotide sugar donor substrates. The difficulty in characterization and discriminate enzymatic products preclude the elucidation of the specific function of putative GTs. In this study， high-energy collision induced dissociation（CID）-negative-ion mode matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI TOF MS） was used to differentiate wfgD（in E. coli O152 O antigen gene cluste） product and wfgD（in E. coli O77 O antigen gene cluste） product. By the mass number analysis， it was found that nearly all of the CID fragment ions were produced by cleavages of diphosphate moiety and glycosidic linkage， while no ring fragmentation was produced. The experimental results demonstrate that the differences in the intensity ratio of fragment ions of [B3] / [Y3] allowed unambiguous differentiation of wfgD product and wfgD product， and when 1 kV is used as the collision energy， the change of collision gas pressure can affect the intensity ratio of fragment ions of [B3]/[Y3]. It was concluded that the abundances of CID fragment ions depended on the stereochemistry of the glycosyl donors in the cleavage of the diphosphate moiety and glycosidic linkage of the lipooligosaccharides（LOS） enzymatic product in MALDI-TOF mass spectra， and CID-MALDI TOF MS analysis of LOS enzymatic product is likely to prove an invaluable tool that can be used to determine the pecificity of O-antigen GT genes.

Keywords Glucosyltransferase; Lipooligosaccharide; Matrix-assisted laser desorption-time of flight-mass spectrometry

（Recieved 28 April 2010; accepted 7 November 2010）